Korean Journal of Biological Psychiatry

서론
동물에서 전기적 현상은 1773년 John Hunter에 의해 전기뱀장어에서 최초로 발견되었으나, 근대 전기생리학은 Luigi Galvani(1737∼1798)에 의해서 시작되었다고 볼 수 있다(김중명 1986；Blakemore 1977). 1784년 Galvani가 개구리 신경을 자극하면 근육이 수축됨을 발견한 이래, 말초 및 중추신경계의 연구에 전기가 사용된 것은 DuBois Reymond(1848∼1849), Fritsch 및 Hitzig, Hess 등 신경 연구의 선구자들에 의해 이루어졌다(Bloom과 Lazerson 1988；Delgado 1981). 여러 형태의 전기적 자극은 일차적인 감각자극을 수용하는 뇌 부위를 밝히는데 사용되었을 뿐만아니라 심리학적 연구에서 동기적 도구로서 널리 사용되어 왔다. 최근에는 이론과 기술적인 면에서의 현저한 발전으로 뇌 기능의 기전을 밝히는 도구로서, 또한 심리적 과정에 근저한 행동적 및 신경생리학적 기전을 규명하는데 유용하게 사용되고 있을 뿐만아니라 치료적 목적으로도 사용되고 있다.
행동의 신경적 기전을 연구하는데 사용되는 가장 중요한 기법은 병소화, 자극, 전기적 기록 및 화학적 분석이다(Bures?와 Huston 1983). 그러나 신경생리학적 연구는 행동의 기전과 더불어 뇌 활동의 공간적인 구조도 설명할 수 있어야 한다. 따라서 저자는 뇌와 행동의 기전을 연구하는 한 방법으로서 신경생리학적 접근에 흔히 사용되는 기본적인 기법을 간략히 정리해 보고자 한다. 여기서는 주로 전기생리학적 기법에 중점을 둘 것이나, 병소화와 자극의 부위를 확인하는데 필요한 신경해부학적 기법에 관해서도 간단히 언급하고자 한다.
실험동물
1. 실험동물의 선택
인간의 뇌와 행동의 관계를 연구함에 있어서 인간이 아닌 다른 종(species)을 사용하는 것이 과연 타당한가의 문제는 아직도 논란이 많다. 종의 선택은 연구에 근저한 문제의 성격에 따라야 한다. 신경생리학적 연구의 노선은 크게 세 방향으로 나눌 수 있으며, 각각 다른 이유로 인해 연구 방향에 따라 사용하는 종이 선택된다(Kolb와 Whishaw 1983).
1) 뇌 기능의 기초적인 기전을 이해하기 위한 연구
이러한 형태의 연구에서는 의문의 성격에 따라 종이 선택된다. 즉, 신경생리학자들은 신경이 크고 접근하기가 쉬우므로 신경활동의 연구에 오징어의 거대신경섬유를 많이 선택한다. 시각연합피질의 역할에 대한 연구에 고양이나 원숭이가 많이 이용되는데 이는 그들은 인간과 마찬가지로 커다란 시각연합부위를 지녔기 때문이다. 때로는 단지 편리함이나 가격 때문에 그 종으로 선택하는 수도 있다.
2) 인간의 신경학적 장애 및 정신질환의 모형을 만들고자 고안된 연구
이러한 연구의 목적은 먼저 그 장애나 그와 유사한 상태를 만들어내고, 그 다음 여러 변인들을 조작해서 그 장애의 원인과 경과를 이해할 수 있게 되도록 시도하고, 결국은 치료를 공식화하는 것이다. 파킨슨씨 질환의 모델은 쥐를 사용하는데 인간의 파킨슨씨 질환의 증상에 타당한 비교를 할 수 있다.
3) 뇌의 계통발생학적(Phylogenetic) 발달을 기술하도록 고안된 연구
뇌의 진화적 발달을 연구하기 위해서는 Hodos와 Campbell(1969)이 말한 준진화순서(quasi-evolutionary sequence)를 구성하는 밀접히 연관된 종을 선택할 필요가 있다. 예를들어 주머니쥐, 고슴도치, 나무두더지, 원숭이는 인간의 조상과 매우 밀접한 살아있는 동물이다.
2. 실험동물의 관리(Animal care)
동물실험에 요구되는 것은 실험동물이 깨끗하고, 안락하며, 질병이 없도록 유지되는 것이다(National Institutes of Health 1991). 대부분의 동물실험은 실험동물에게 불편을 가져오며, 실험자는 가능하면 이들의 불편을 극소화시키도록 계속 노력해야 한다. 미국 신경과학학회(Society for Neuroscience)의 연구용동물위원회(Committee on Animals in Research)에서 제정한 “신경과학 연구에서 동물 사용에 관한 지침서”에 기술되어 있는 내용중 일부를 소개하겠다(Society of Neuroscience 1992).
1) 실험의 고안에 관계된 요소
윤리적인 동물실험의 기본 원칙은 실험동물이 피할수도 있는 고통이나 불편을 그대로 받도록 되어서는 안된다는 것이다. 실험계획을 고안할 때 연구자들은 사용할 동물의 수를 최소화시키고, 위험에 놓인 동물을 소모하지 않도록 고안해야 한다. 실험 방법의 진보, 동물의 좀더 효율적인 사용, 대상내 고안(within-subject designs), 현대적인 통계기술 등이 연구에서 사용되는 동물의 수를 최소화시킬 수 있는 방법들이다.
2) 실험의 실행에 관계된 요소 실험동물은 “NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”의 지침을 따라 얻어지고 보살펴져야 한다(National Institutes of Health 1985). 다음은 1978년도 NIH Guide for Grants and Contracts에서 일부 발췌한 동물사용의 원칙이다(National Institutes of Health 1978).
① 살아있는 척추동물 및 연구를 목적으로 살아있는 동물로부터 수취한 조직을 포함하는 실험은 즉시 자격있는 생물학, 행동학, 또는 의학 과학자의 감독하에 수행되어야 한다.
② 모든 실험동물의 주거, 돌봄, 급식은 자격있는 수의사 또는 그러한 일에 능력있는 다른 과학자의 감독을 받아야 한다.
③ 그 연구는 사회적 이익을 위한 풍부한 결과를 얻을 수 있으며, 무작위적이거나 불필요한 성질의 것이 아니어야 한다.
④ 실험은 연구에 근저한 질환이나 문제의 지식을 기초로 하며, 기대되는 결과가 실험의 수행을 정당화시킬 수 있어야 한다.
⑤ 통계적 분석, 수학적 모델, 시험관내의 생물학적 체계는 동물실험을 보완하기에 적합하며, 사용되는 동물의 수를 감소시킬 수 있도록 사용되어야 한다.
⑥ 실험은 동물에게 모든 불필요한 고통과 손상을 피하도록 시행되어야 한다.
⑦ 실험을 책임지고 있는 과학자는 실험의 지속이 동물에게 불필요한 손상이나 고통을 초래한다고 믿으면 언제든지 실험을 끝낼 준비가 되어 있어야 한다.
⑧ 만약 실험이나 시술이 마취한 것보다 더 큰 불편을 가져오면 먼저 그 동물이 통증을 지각할 수 없게해야 하며, 실험이나 시술이 끝날 때까지 그 상태가 유지되어야 한다.
⑨ 동물의 수술후 관리는 수의학적 조치에 따라 불편과 실험으로 초래된 불구의 결과를 극소화시키도록 해야 한다.
⑩ 만약 실험동물을 희생시킬 필요가 있으면 그 연구소의 위원회에서 허용하는 절차에 따라 인도주의적인 태도로, 즉사가 확실한 방법으로 시행되어야 한다. 어떠한 동물도 사망이 확실하기 전까지 폐기되어서는 안된다.
3. 실험동물의 마취
1) 약물투여의 원칙
실험동물에 약물투여시 제일 먼저 인식해야 할 중요사항은 종에 따라 대사율, 약물대사의 효소적 경로가 다르므로 종에 따라 특정약물에 대한 반응을 변화시킬 수 있다는 점이다. 예를들면 고양이에게 morphine을 투여하면 과잉흥분 반응을 보인다. 또한 동물 개개의 차이에 따라 단일 종에서도 약물투여에 대한 반응에 질과 양적인 차이가 있다는 점을 인식해야 한다. 이 경우 반응의 변화는 체중, 연령, 성별, 성질, 투여경로, 건강상태나 질병, 과거의 약물경험 등에 의한다. 마지막으로 실험동물에 투여한 약물은 실험결과에 영향을 끼치므로, 약물을 투여하기 전에 임상가와 연구자 간에 충분한 대화가 무엇보다 필요하며, 투여된 용량을 정확히 기록하는 것도 중요하다.
2) 약물투여 경로
(1) 경구투여
먹이나 물에 섞어서 주는 경구투여법은 편리하다는 장점이 있으나 질병, 입맛의 변화, 용액속 혹은 공기나 빛에의 노출로 인한 약물의 안정성의 문제로 섭취가 감소될 가능성이 있다. 여러 삽관법으로 투여하기도 하고, 큰 동물 종에서는 알약으로 투여하기도 한다.
(2) 정맥내 투여
정맥내 경로로 약물을 투여하려면 각각의 종별로 주사를 놓기 쉬운 말초정맥의 위치를 알아야하며, 신체적 구속과 정맥천자의 기술이 있어야 한다. 정맥내 투여의 이점은 혈중 약물농도가 빨리 증가되며, 신체의 조직과 기관에 즉시 분포되는 것이다. 마취제의 선택은 수술유형에 달렸으며, 예를들어 백서에서 오랫동안 마취가 필요한 급성실험에서는 barbiturate가 흔히 사용된다.
(3) 복강내 투여
복강내 투여는 자극성이 없는 다량의 용액제제를 투여하는데 유용하며, 약물작용의 개시율은 정맥내 투여후의 약 ½ 내지 ¼이다(Latt 1976). 어른 흰쥐 수컷에서 pentobarbital은 체중당 30∼40mg/kg 사용하며, 흔히 1ml의 증류수나 생리식염수에 용해시킨 용액을 체중 100g당 0.1ml 사용한다(Ben 등 1969). Hexobarbital은 100mg/kg의 용량으로 복강내 투여한다.
(4) 근육내 투여
이는 소량의 자극성인 약물 투여에 사용된다. 약물 작용 시작은 정맥내 투여와 피하투여의 중간 정도이다. 근육내 주사는 대퇴 상부 근육과 둔근에 놓으나, 더 큰 종에서는 등의 근육에 놓기도 한다(최철순 1985).
(5) 피하투여
비자극성인 약물의 느리고 지속적인 흡수가 요구되는 때에 사용하며, 목의 뒷부분이나 액와 부위의 피하에 놓는다.
(6) 흡입마취
흰쥐에서 가장 안전하고 쉽고 경제적이며 널리 쓰이는 흡입마취제는 ether이며, 호흡반사와 근긴장도를 관찰함으로써 마취의 깊이를 결정할 수 있다. 예를들면 무통과 섬망 단계에는 호흡이 불규칙적이고 빠르며, 반사와 근긴장도는 거의 변하지 않으나, surgical anesthesia(plane 3)에 달하면 호흡은 규칙적이고 좀더 얕아지며, 반사는 없어지고, 골격근은 힘이 없어진다.
3) 약물투여 용량
동물의 마취에 많이 쓰이는 약물의 용량(Kruckenberg 1979 ；Latt 1976)을 발췌해 보았다(표 1).
전기생리학적 동물실험의 기법
1. 정위법
병소만들기, 화학물질의 주입, 자극, 기록 등 대부분 뇌의 실험적 조작에 정위법(stereotaxic technique)의 응용이 요구된다. 정위적 기구는 뇌 도해서에 적혀있는 좌표를 기초로하여 뇌의 특정 부위에 전극과 관을 정확한 위치에 놓게 한다. 흰쥐의 뇌 도해서는 몇가지가 있으나, Pellegrino 등(1979)이 만든 두 유형의 정위적 좌표가 적힌 흰쥐의 뇌 도해서가 흔히 이용되고 있다(그림 1).
1) System A
이것은 de Groot(1959)의 좌표 체계이다. 여기에서 수평기 저면(horizontal zero plane)은 상절치능(upper incisor bar)과 이간선(interaural line)에서 0.5mm 상방의 접선으로서 전교련(anterior commissure)과 후교련(posterior commissure)을 통과한다. 배측-복측좌표(dorsal-ventral coordinate)는 각 도해면의 우측에 눈금으로 나와있다. 문미좌표(rostral-caudal coordinate)는 관상도해에서 우측 상부에 적혀있고, 시상 도해에서는 밑에 눈금으로 나와있다. 이것은 수직기저면(vertical zero plane)의 후부에 있으면 (-)로 표시된다. 내측좌표(medial-lateral coordinate)는 관상도해의 밑에 눈금으로 표시되고, 시상도해에서는 우측 하단에 적혀있다.
2) System B
이것은 de Groot 체계를 간단히 수정한 것으로서 관상도해에서만 사용할 수 있다. 문미 기저점은 두개골의 관상봉합과 시상봉합이 교차되는 지점인 전정(bregma)이며, 문미좌표는 관상도해의 좌상단에 적혀있다. 전정의 후부는 (-)로 표시된다.
2. 병소만드는 방법
여러 유형의 병소화 기법은 수년간 신경회로와 기능을 분석하는데 널리 사용되어 왔다. 병소적 접근의 이론적 배경은 척추동물에서 축삭절단(axotomy) 후 축삭의 분리된 뒷부분에 변성이 오고(anterograde degeneration), 세포체에 축삭반응(axon reaction)이라 부르는 변화가 일어나다가 결국 세포사망(retrograde degeneration)에 이르며, 같은 회로에서 손상받은 신경단위와 직접 또는 간접적인 연접을 하는 신경단위의 위축이나 변성을 초래할 수도 있다(transneuronal degeneration)는 실험 결과들과 연관된다(Jonsson 1981). 병소를 만들기 위해 수년간 수술적 또는 전해적인 비선택적 기법이 흔히 사용되어 왔었으나, 최근 이십년 전부터 화학적 신경독적 접근법이 발달되고 있다.
1) 비선택적 병소화 기법
① 절개도로 신경경로나 구조물을 절단하는 절개도 기법(knife methods).
② 전극을 통해서 직류가 지나가게 하거나(electrolytic methods) 또는 고주파(radiofrequency current)를 지나가게 해서 열응고(thermocoagulation)로 구조물을 파괴시키는 기법：직류 전기분해(DC electrolysis)는 기체 방울의 생산이나 금속성 이온의 확산에 의해서 조직을 파괴시킨다. 전극 끝 주변의 손상범위는 전류의 양과 전류가 흐르는 기간에 달렸다. 이 외에 중요한 지표로서 전극 끝의 직경, 비절연 부위의 범위, 전극을 구성하는 금속의 유형, 전극의 극성(양 또는 음), 손상받은 조직의 성질(회백질 또는 백질) 등을 들 수 있다(Huston 1983). 따라서 믿을만한 지침을 제공하기는 어려우므로, 연구자들은 전류 수준과 기간을 다양하게 변화시켜서 행한 예비실험의 지표를 기초로 함이 좋다. 예를들면 흰쥐의 편도에 1mm 직경의 타원형 병소를 만들려면 0.5mm 비절연시킨 0.2mm 직경의 stainless steel 전극 끝으로 1mA의 양전류(anodal current)를 10초간 지나가게 하면된다(Huston 1983). 전류의 강도와 시간을 두배로 늘리면 2mm 직경의 병소를 만들 수 있으나, 흰쥐 뇌에 대해서 5mA 이상의 전류는 바람직하지 않다. 전극은 platinum이 좋으나, 보통 stainless steel 전극이 사용된다. 일반적으로 흰쥐에서 1∼3mm 직경의 병소를 만들려면, 직경이 0.2∼1.0mm 사이의 전극을 사용한다.
③ 절개도나 흡인(aspiration technique)을 통해서 조직을 제거하는 기법.
④ 냉각, 확산억제(spreading depression), 국소마취, 간질의 유도에 의한 가역적인 기능적 병소화.
2) 선택적 병소화 기법
① 6-hydroxydopamine에 의해 catecholamine을 고갈시키고 ibotenic acid에 의해 세포체의 선택적 파괴를 일으키는 장기적인 효과, 또는 p-chlorophenylalanine에 의한 serotonin의 고갈과 같은 단기적 효과 등 신경화학적 병소.
가. Monoamine neurotoxins：6-hydroxydopamine, 6-hydroxy-DOPA, 6-aminodopamine, DSP4, guanethidine, dihydroxytryptamines, halogenated amphetamines.
나. Excitotoxic amino acids：kainic acid, ibotenic acid.
② Nerve growth factor에 대한 antiserum, dopamine-β-hydroxylase에 대한 항체의 사용 등 면역학적 병소화.
③ 기타 capsaicin, colchicine과 vinca alkaloids, pronase와 같은 단백질 용해효소의 세포내 주입, Lucifer yellow CH 등 형광염료 주사후 청색빛을 조사함으로써 변성을 일으켰다는 보고도 있다(Jonsson 1981).
3. 전기적 자극법
신경단위막을 통과하는 전류는 이온에 대한 투과성을 변화시켜서 신경의 자극파동을 유발시킨다(Dubel 1985；Brazier 1977). 전기적인 뇌자극 기법은 뇌와 행동의 관계를 밝히기 위한 다음과 같은 실험에서 유용하게 쓰이고 있다(Huston 1983).
① 전기적인 자기자극(self-stimulation).
② 피질하 자극에 의한 복잡한 행동의 도출.
③ 사지운동이 자극에 의해 유발될 수 있는 대뇌피질 운동영역의 지도화.
④ 고전적인 조건화 연구에서 조건 또는 무조건적인 자극으로서 사용.
⑤ 인간에서 뇌 자극에 의해 경험을 말하거나 회상하게 하는데 사용.
⑥ 기억상실을 유도하거나 반대로 학습을 촉진시키는데 사용.
1) 일반적인 방법
전극은 목적에 따라 단극성 또는 양극성 전극을 사용할 수 있다. 그러나 자극 전류의 확산을 정확하게 한정지을 수 있으므로 0.5∼1.0mm 간격으로 가까이 놓은 양극성 전극이 널리 쓰이고 있다. 부식하지 않으므로 장기적인 뇌 자극에 백금이 가장 좋 으나, 더 싸고 쉽게 구입할 수 있는 stainless steel 제품이 많이 쓰인다. 철사 끝의 직경은 0.1∼0.3mm로서, 끝을 제외하고는 절연되어야 한다.
전기적 자극은 train duration, pulse duration, pulse frequency, amplitude 등의 지표를 조절할 수 있는 상품화된 stimulator를 사용한다(그림 2). 전해로 인한 손상은 교류(AV) 자극으로 극소화시킬 수 있으나, 0.1∼0.5msec 동안의 매우 짧은 단일 방향의 직류(DC) 파동(pulse)이 쓰일 수도 있다. 전기적 자극의 voltage는 oscilloscope을 통해 알 수 있으며(Delgado 1961), 다음의 Ohm의 법칙에 의해 전류수준을 측정할 수 있다.
Current(I)＝Voltage(E) / Resistance(R)
자극의 빈도는 30∼100Hz 사이가 많이 쓰이며, 일연의 자극(stimulus train)의 지속시간은 일반적으로 자기자극실험에는 0.1∼0.5sec 동안, 자극에 연결된 행동을 유발시키는 실험에서는 1분까지도 가능하다(Huston 1983).
2) 세포외자극(Extracellular stimulation) 및 세포내자극(Intracellular Stimulation)
세포외자극법(Ranck 1981)에서 전류가 세포외로 통과할 때 대부분의 voltage변화는 세포밖의 voltage에 있으므로, 세포밖의 voltage를 변화시킴으로써 일차적으로 막통과전위(transmembrane potential)를 변화시킬 수 있다. 신경단위에서 직류의 흐름과 연관된 voltage 변화는 두종류가 있다. 즉, 세포질의 저항을 통한 전류의 흐름에 의한 voltage 변화와 막저항을 통과하는 전류의 흐름에 의한 voltage 변화이다.
세포내자극법(Byrne 1981)에서 개개 신경단위의 막전위를 변화시키는데 사용되는 가장 단순한 방법은 하나는 막전위를 기록하는데 쓰고, 하나는 자극하는데 쓰는 두 미세전극을 세포에 꽂는 것이다(그림 3). 그러나 이 기법은 개개의 신경단위가 크고 표면에 있는 무척추동물 신경절(ganglia)에서 가능하며 척추동물에서는 힘들다.
3) 미세자극법(Microstimulation technique)
미세자극법(Asanuma 1981)은 전극 근처의 작은 부위에 위치한 신경단위군을 자극하기 위해 고안되었으며, 이 기법의 장점은 같은 전극으로 동일한 신경단위군을 자극하고 기록할 수 있다는 점이다. Pipette과 금속전극이 다 쓰이나, 금속전극은 저항(impedance)이 더 낮아서 자극과 기록을 안정시킬 수 있으며, 속에 금속철사가 들어 있어서 삽입시 조직으로 막히지 않고, 끝이 더 단단해서 목표에 똑바로 나아갈 수 있으며, 전극이 지나간 길을 다시 만들기 위한 병소만들기가 더 쉽다.
전극은 조직 손상을 피하기 위해서 작아야하며, shaft는 자극전류가 새는 것을 막기 위해 medium으로부터 절연되어야 한다. 이 목적을 위해 glass pipette을 사용하는데, 이는 바깥 직경이 0.2mm인 표준유리관의 끝을 electrode puller로 가늘게 늘리고 이 끝의 직경이 10μm가 되도록 부러뜨린다. 그 다음 tungsten wire를 끝까지 집어넣고, 튀어나온 부분은 노출된 끝이 10∼15μm가 되도록 현미경 하에서 전해적 부식(etching)으로 짧게 만든다. 부식을 위해 50% KCN과 30% NaOH 혼합액을 사용하며 2∼6V의 교류를 준다. 이 전극은 100μA 이상의 전류 파동을 통과할 수 있으나, 이 이상에서는 전극 끝에서 기포가 생기고 조직이 파괴된다. 일반적으로 좀더 긴 train(30∼40msec)의 고빈도(300∼400Hz)의 파동이 훨씬 효과적이다. 전극의 자국을 찾아내기 위해서는 10초 동안 5, 10, 20A의 음전류를 사용하며 병소의 크기는 각각 100, 200, 300μm이다.
4) 뇌의 심부자극(Depth Stimulation)(Delgado 1981) 조직전도성(conductivity)은 수분함량에 달렸으며, 뇌 내에서는 구조물에 따라 다르다. 심부자극에서는 작은 접촉으로 인해 이러한 문제가 극소화된다.
4. 측정 및 기록
측정도구로는 volt-ohm-ammeter, 표준 cathode-ray oscilloscope(CRO), audio generator, pulse generator, resistors, capacitors, test board, soldering iron 등이 필요하다(Bures?와 Huston 1983).
저자가 행한 전기생리적 실험에서 얻어진 기록의 자료를 예로 들겠다. 그림 4는 정위기구를 사용해서 흰쥐 척수에 미세절개도로 병소를 만든 후 대뇌피질의 운동영역에서 기록한 실험의 예이다(Park 등 1990). 그림 5는 정위법을 사용해서 부위를 결정한 흰쥐의 적핵과 망상핵에 전기적 자극을 가하고 척수에서 기록한 실험의 예이며(Kim 등 1989；Park 등 1989), 그림 6는 정위기구를 사용해서 흰쥐의 척수에 전극을 꽂아 일정 깊이에서 심부 기록한 예이다(Cheon과 Levy 1991；Cheon 등 1989a；Cheon 등 1989b).
조직학적 검사
전기생리학적 실험의 기록이 끝나면 반드시 자극 또는 병소를 만든 부위를 신경해부학적으로 확인해야 한다. 여기에서는 실험실에서 많이 사용하는 심장내관류법과, 들어낸 뇌조직의 동결절편 후에 cresyl violet 및 neutral red 염색 등 기본적인 신경조직의 염색법에 대해 간단히 설명하겠다.
1. 심장내 관류법(Bures?와 Huston 1983；Forssmann 1981)
동물을 관류하기 위해서는 선택한 고정액(흔히 사용되는 고정액은 glutaraldehyde, ethanol 및 formalin)을 운반하는데 혈액순환을 이용한다. 따라서 용액은 대강 동물의 정상혈압에 상당하는 압력에서 통과하도록 해야한다. 예를들어 고정액이 담긴 병을 동물로부터 150cm 위에 매달면 된다. 그림 7에 그려진 관류계는 두개의 병(하나는 0.9% saline용액, 다른 하나는 고정액이 담긴), 양분된 고무나 polyethylene tube 및 3-way faucet으로 구성된다.
마취된 동물의 등을 밑으로 놓고, 흉골의 좌우를 수술용 가위로 잘라서 흉곽을 연다음, 고무관에 고정시킨 삽관을 좌심실에 삽입하고, saline이 흐르도록하며, 좀더 빨리 혈액이 용액으로 대치되도록 우심실을 작게 자른다(그림 7). Saline이 혈액을 밖으로 씻어낸 후, formalin 관류액이 혈액순환계에 흐르도록 한다.
10% buffered formaldehyde solution(pH 7.3∼7.5)을 만들기 위해서 9g NaCl, 4g sodium dihydrogen phosphate-1-hydrate(NaH2PO4·H2PO), 8.25g disodium hydrogen phosphate-2-hydrate(Na2HPO4·2H2O)을 900ml의 증류수에 용해시키고, 그다음 100ml의 formalin stock solution(37.5%)을 첨가한다.
2. 뇌의 박리
수술용 가위와 rongeur를 사용해서 두개골을 제거하고 뇌를 10% formalin액에 최소한 하루동안 담가둔다.
3. 조직괴 만들기(Blocking)
전극의 삽입한 방향에 평행되게, 실험중 사용한 정위적 도해서를 참고로 절편을 만든다. 조직학적으로 검사하고자 하는 뇌부위로부터 2∼3mm 앞뒤로 절단하는 것이 좋다.
4. 동결절편법(Frozen sectioning)
동결절편법은 시간이 적게드는 이점이 있으므로 널리 쓰이며, 보통 25∼100μm 두께로 절편을 만든다(Gruber 1981).
5. 봉입(Mounting)
조직을 0.5∼1%의 formalin이나 물이 담긴 그릇에 넣고, 붓으로 gelatin을 묻힌 slide에 올린다.
6. 염 색
정규적으로 사용하는 염색법은 cresyl violet stain, neutral red stain 및 Kluver-Barrera stain이다. 이 방법에서는 절편을 gelatinized slide 위에 mount하고 염색 전에 건조시킨다.
동결절편한 뇌조직을 염색하는 순서는 다음과 같다.
1) Neutral red 염색법(LaBossiere와 Glickstein 1976)
1g의 neural red를 100ml의 증류수로 용해시킨다. 그다음 4ml의 acetate buffer(pH 4.8)를 가한다. Acetate buffer는 750ml 0.1N sodium acetate가 혼합된 500ml 0.1N acetic acid로 구성된다. 이 용액은 사용하기 전에 여과하고 Nisslsubstances의 염색을 호전시키기 위해서 40℃까지 가열한다.
1∼3분간 염색
증류수 30초
70% ethanol 30초
95% ethanol 30초
100% ethanol 30초
100% ethanol 1분
xylene 1분
xylene 1분
coverslip
2) Cresyl violet 염색법(LaBossiere와 Glickstein 1976；Clark와 Clark 1971)
0.25∼0.5g cresyl violet을 100ml의 증류수에 용해시킨다. 이 원액은 혼합후 여과하여 실온에서 어두운 병에 넣어 보관한다.
3분간 염색
증류수 30초
50% ethanol 1분
70% ethanol 1분
95% ethanol에 몇 방울의 빙초산1∼7분
95% ethanol 30초
100% ethanol 5분
100% ethanol 5분
xylene 5분
xylene 5분
coverslip 5분
3) Kluver-Barrera 염색법(Bures?와 Huston 1983)
Neutral red와 cresyl violet은 수초화(myelinated)섬유의 Luxol fast blue염색과 혼합하여 Kluver-Barrera염색이 된다. Luxol fast blue의 0.1% stock solution을 만들기 위해서 1g Luxol fast blue를 1000ml의 96% ethanol에 용해시키고, 그다음 5ml의 10% acetic acid를 첨가한다. 이 용액은 혼합후 여과하여 사용하기전 최소한 24시간 동안 저장해 둔다. Luxol fast blue로 염색하기 위해서 절편은 96% ethanol에 10분간 담가두고, 그다음 연구실 오븐 속에서 56℃에 2∼4시간 동안 Luxol fast blue에 담가둔다. 염색이 끝난후 절편은 96% ethanol로 세정하고, 증류수로 씻어서 5분동안 0.05% 액체 lithium carbonate용액으로 이전한다. 절편은 70% ethanol 속에서 1∼3분동안 분별시키고 증류수로 세정한다. 그다음 cresyl violet(6∼10분) 또는 neutral red(2∼4분)으로 상기한 순서에 따라서 대비염색(counterstain)한다.
4) 정상 축삭(axon)에 대한 Reduced silver stain(Bures?와 Huston 1983)
Vogt reduced silver염색은 silver impregnation기법의 일종으로서, 뇌에 병소를 만든후 손상받지 않은 섬유가 어떤 것인지 알기 원할 때 사용할 수 있다. 이는 특히 kainic acid 병소, electrolytic 병소 및 knife cut 후에 유용하다. 이를 위해서는 필수적으로 뇌를 매우 잘 관류해서 30% sucrose-formalin 용액에 최소한 2주간 저장해야 한다.
뇌의 동결절편을 증류수에 넣고, silver-pyridine용액에 8∼16시간 담가둔다. 절편을 이 용액에서 꺼내서 증류수로 세정하고, 100ml의 silver-pyridine 용액에 12ml의 alkali 혼합물을 섞은 용액에 2.5∼3분간 넣어둔다. 그다음 이를 환원제에 넣어 1분씩 두번 교환하고, 증류수에 최소한 두번 세정해서, 30∼60 초동안 Weigert용액에 넣어 분별하고, 마지막으로 증류수로 세정한다.
5) 퇴행하는 섬유의 Silver impregnation(Bures?와 Huston 1983)
퇴행하는 섬유의 규명은 뇌 병소화의 범위를 평가하는 고전적인 방법중 하나이다. 14일 동안 30% sucrose-formalin용액에 넣어 고정시킨 후, 절편을 증류수로 세정해서, 2.5% uranyl nitrate용액에서 5분간 배양시킨다. 그다음 ammoniacal silver 용액으로 이전해서 3∼15분간 둔다. 세정하지않고 절편을 환원제에 2∼5분간 담가둔다. 그다음 세정하고, 0.5% 액체 sodium thiosulfate에 2분간 담가둔다. 세정하고, gelatinized slide에 올리고, ethanol에서 탈수시킨 후 xylol로 닦고 coverslip을 덮는다.
6) 단가아민계 신경단위의 Histofluorescence(Heym 1981)
조직화학적 형광법은 중추 단가아민 경로의 지도화에 사용되어 왔으며, 이는 또한 퇴행 및 재생하는 단가아민 신경단위의 연구에도 이용되고 있다. 동물을 단두하여 관류하지 않은 뇌를 두개골로부터 꺼내서 -30℃로 냉동시킨 cryostat에 올려놓고 절편을 만든다. 절편이 놓인 slide를 sucrose-phosphate glyoxylic acid(이하 SPG)용액에 1초씩 3번 잠그고, 반시간 동안 hair dryer로 말린다. 절편을 한두방울의 광학 USP mineral oil로 덮고 연구실 오븐에 2.5∼3분간 넣었다가 꺼내서 coverslip을 덮는다.
7) Horseradish peroxidase에 의한 신경해부학적 추적(tracing)(Schubert 1981)
고추냉이(horseradish)의 효소인 horseradish peroxidase(이하 HRP)는 뇌에 주입시 축삭말단에 내포되어(endocytosed), 모계의 세포체로 축삭내 및 역행하여 이동한다. HRP는 hydrogen peroxide를 물과 산소로 환원시키는 것을 촉매하며, 이 산소는 치환된 benzene과 benzidine 분자를 polymer로 중합하는데 이용된다. 이 polymer는 HRP를 취한 신경단위에서 발색반응 산물로 알아 볼 수 있다. Tetramethylbenzidine(이하 TMB) 및 diaminobenzidine tetrahydrochloride(이하 DAB)방법 등이 이러한 목적에 사용된다.
행동시험
1. 선천적 및 동기적 행동(Huston과 Bures? 1983)
1) 행동양상
동물의 행동에 관한 유용한 정보는 home cage나 잘 규정된 시험 상황에서 나타내는 활동의 양적 관찰에 의해 얻어질 수 있다. 이러한 연구에 미리 요구되는 것은 기록된 행동양상의 정확한 정의와 이를 양적으로 가늠할 수 있는 믿을만한 과정이다. 1961년 Bindra(1961)에 의해 제안된 시간-표본법(time-sample method)은 많은 실험에 응용할 수 있게 쉽게 수정이 가능하며, 만족스러운 결과를 얻게 해준다. 이것은 나타내는 주요 행동양상을 나열하고, 상대적인 빈도와 기간을 측정한다. 생후 2∼3개월된 흰쥐를 투명유리로 만든 벽과 천장과 바닥이 철망으로된 30×25×20cm 상자에서 3일간 적응하도록 둔다. 4일째 관찰자가 자막뒤로 모습을 감춘지 10분후에 관찰을 시작한다. 수면, 눕기, rearing, 걷기, 먹기, 물마시기, 몸치장하기 (grooming) 및 기타(앉기, 몸뻗치기, 격리된 다리와 머리운동) 등 8가지 항목의 행동을 관찰한다.
2) 일반활동의 측정
행동의 중요한 지표중 또 다른 것은 활동-비활동 연속(activity-inactivity continuum)이다. 이 방법은 회전바퀴법(revolving wheel) 및 activity cage법으로 나뉜다. 회전바퀴법은 직경 35cm 및 폭 10cm인 drum을 사용해서 흰쥐의 운동(locomotion)을 측정한다. 두번째 방법은 운동 뿐만아니라 rearing이나 grooming 등 다른 활동도 측정할 수 있다.
3) Depth avoidance
올라간 platform에서 깊은 표면으로 떨어지는 나쁜 결과를 피하는 능력은 적응상 매우 큰 의미를 지니는 선천적인 반응이다. 이것은 시각 또는 비시각적 단서에 의해 중계된다. 흔히 cliff apparatus가 사용된다.
4) Open field
흰쥐는 잠재적으로 위험한 자극에 대해서 freezing으로 반응한다. 동물을 우리보다 상당히 큰 불이 환하게 켜진 상자에 넣는다. 부동자세는 두려움의 한 증상으로 간주되므로, 표준자극에 의해 야기된 두려움의 강도는 동물의 정서성(emotionality)을 반영한다. 정서상태는 또한 여러 식물학적현상(심박동의 증가, galvanic skin response, 동공의 확산 등)을 동반한다. 활동 측정과 더불어 편리하게 평가될 수 있는 자율기능은 배변이다. open field에서 덜 움직이고 더 배변을 많이하는 동물은 더 정서적으로 간주된다.
5) Electrocutaneous shock
피부의 전기적 자극은 실험조건에서 혐오적인 동기를 만드는데 가장 널리 쓰이는 방법이다. 흰쥐를 apparatus에 놓고 5분간 탐사하게 한다. 전기적 충격은 30초 간격으로 가한다. 충격 의 voltage는 10V부터 150V까지 10V씩 증가시키고 다시 감소시킨다. 각각의 충격에 대한 동물의 반응은 무반응, 움찔함(flinch), jump 등으로 분류하고, vocalization반응도 기록한다.
6) Agonistic behavior
Agonistic behavior라는 용어는 경쟁적인 상황에서 일어나는 복잡한 행동 등을 말한다. 이것은 노골적인 공격에서부터 순종과 도망에 이르기까지 모든 갈등행위를 포함한다. 그러나 공격, 수비, 순종은 다른 신경회로에 의해 조절되는 것으로 알려졌다. 다른 신경화학적 및 신경생리학적 뇌기전에 연관된 유용하고도 흔한 구분은 감정적 공격(affective aggression)과 약탈적 공격(predatory aggression)으로 나누는 것이다. 감정적 공격은 교감신경계의 각성과 수비 또는 위협적 자세, vocalization, 물거나 할퀴는 등을 포함하는 분노의 증후를 동반한다. 연구실에서 agonistic behavior를 연구하는 방법은 뇌병소화, 약물, 전기적 뇌자극, 격리-유도된 격투(isolation-induced fighting), 통증-유도된 격투, 약탈적 공격, 조작적 공격, extinction 및 schedule-유도된 공격, 자발적 공격, agonistic 행동의 전체 spectrum을 기술, 학습에 의한 agonistic 행동의 수정 등이 있다.
생쥐에서 흔히 관찰되는 행동양상으로서 공격직전 행동은 offensive-sideways, offensive-upright, mutual upright posture, aggressive groom, mincing, tail-rattling 등이 있다. 실제적인 공격은 반복적으로 뛰어오르면서, 직접 꼬리와 둔부 및 옆구리를 물고, chasing도 보인다. 공격을 당하는 동물에서 관찰되는 행동은 escape, crouch, defensive-upright, defensive-sideways, freeze, full submission posture 등이 있다.
(1) Pain-induced aggression(Cheon 1993)
Shock-induced aggression을 시험하기 위해 1mA의 전기적 충격을 0.5초 동안 가하고 전류를 점차 2mA까지 올린다. 전류의 강도, 빈도 및 기간에 따른 여러 격투행동과 자세의 발생 빈도를 기록한다.
(2) Operant aggression
체중 300g가량의 흰쥐의 시상하부측핵(lateral hypothalamus)에 자극하는 전극을 심고, self-stimulation 방법으로 실험한다.
(3) Isolation-induced aggression
생쥐를 4주동안 격리시키고, 실험용 우리로 옮긴 후 10분간 낯익게하고, 단체로 키운 생쥐를 집어넣어 5분동안 격투의 빈도와 문자국수, 공격의 잠복기 등을 기록한다.
(4) Spontaneous aggression
우리당 5마리의 생쥐를 집어넣고 1∼2주간 살게한 다음, 꼬리에 색갈을 칠한다. 다른 종류의 생쥐 우리에 집어넣고 15분 동안 공격행동을 관찰한다.
(5) Submissive behavior
다른 종류의 흰쥐를 순차적으로 시험상자에 넣어 나타나는 순종행동을 관찰하며, 이를 3일간 반복하여 학습의 정도를 평가한다.
7) Feeding 및 Drinking
흰쥐에게 3일간 음식을 박탈하고, 그다음 매일 2시간씩 음식으로 강화시키면서 1분간의 고정된 간격하에 lever-press를 4 ∼7일간 훈련시키는 schedule-induced polydipsia법이 있다.
8) Sexual behavior
난소척제술(ovariectomy) 및 거세후 관찰되는 성적 행동에 대해서 기록한다. 흰쥐 수컷에서 성교의 흔한 척도로는 올라타기(mounts), 삽입(intromission), 사정, 척주전만(lordosis), 척주전만의 시간 등이 있다.
9) Filial behavior
새로 부화한 병아리에게 움직이는 물체에 대한 각인(imprinting)을 기술한다.
10) 욕구강도의 측정
Columbia obstruction box 속에서 흰쥐에게 시작하는 상자와 강화(reinforcement)를 주는 상자 사이에 놓인 전기 격자를 횡단하게 한다.
2. 학습과 기억(전진숙 등 1998；전진숙 1997；Cheon 1993 ；Bure?ova 와 Bures? 1983)
1) Classical conditioning
① 자율반응：심박동수 조건화, galvanic 피부반응 조건화
② 신체적 반응：호흡 조건화
2) Avoidance conditioning
① Passive avoidance(그림 8)：step-down, step-through, two-compartment test, 쪼아먹음의 억제
② Conditioned taste aversion
③ Active avoidance(그림 9)：runway avoidance, shuttle-box avoidance, circular runway, jumping avoidance, shock-source avoidance, swim escape
3) Operant conditioning
① Skinner box techniques
② Discrete skilled movements
4) Discrimination learning
식별연구는 조건자극으로 작용할 수 있는 환경적 사건이나 상태의 연구에 집중한다.
① Spatial discrimination
보통 단순한 T형 미로(그림 10)나 Y형 미로를 사용해서 흰쥐에게 좌우를 식별하게 한다.
② Simultaneous 또는 successive brightness discrimination
③ Pattern discrimination
④ Temporal discrimination
5) Memory
(1) Working memory(전진숙 등 1998；전진숙 1997；Bure?ova와 Bure? 1983)
단기기억은 지연된 반응, 지연된 변화, 지연된 자극조합 등에서 검사된다. 단기기억의 획득은 학습이라고 말할 수 없다. 이것은 계속적인 경험적 기록의 일부로서, 지각의 부산물로서 자동적으로 형성된다. 단기기억의 연구실 시험은 보통 식별자극과 같은 공간적 또는 특수한 감각적 단서를 사용해서 다소 추상적인 상황에 기초를 두며, 방사형 미로(radial maze)가 흔히 이용된다(그림 11).
(2) Reversed postoptokinetic nystagmus
기억기능에 관계되는 편리한 연구 모형으로서 흔적(trace)현상이 흔히 이용된다. 토끼에서 일어나는 안구진탕(nystagmus)의 기록에 oculography 및 EEG기구가 사용된다.
요약
동물에서 전기현상은 1773년 최초로 발견되었으며, 최근에는 이론과 기술적 면에서의 현저한 발전으로 뇌기능의 기전을 밝히는 도구로서, 또한 심리적 과정에 근저한 행동 및 신경생리학적 기전을 규명하는데 유용하게 사용되고 있을 뿐만아니라 치료적 목적으로도 사용되고 있다. 저자는 뇌와 행동의 기전을 연구하는 한 방법으로서 신경생리학적 접근에 흔히 사용되는 기본적인 기법을 간략히 정리해 보았다. 여기서는 주로 전기생리학적 기법에 중점을 둘 것이나, 병소화와 자극의 부위를 확인하는데 필요한 신경해부학적 기법에 대해서도 간단히 언급하였다.
실험동물의 선택, 실험동물의 관리, 실험동물의 마취에 있어서 약물투여의 원칙, 투여경로 및 용량 등 동물실험에 있어서 기본적으로 알아야할 사항에 대해서 실제적으로 언급하였다.
전기생리학적 실험에 필요한 정위법, 비선택적 및 선택적 병소화 기법, 전기적 자극법(일반적인 방법, 세포외 및 세포내 자극, 미세자극법, 뇌의 심부자극), 측정 및 기록을 위한 제반 기법을 소개하고 실예를 보여주며, 조직학적인 부위 확인을 위해 필요한 일연의 과정으로서 심장내관류법과 흔히 사용되는 신경계의 염색법에 대해서 간략히 설명하였다. 또한 기능상의 변화를 측정하는데 필요한 행동검사의 종류도 언급하였다.
신경생리학적 연구 방법은 뇌와 행동의 관계를 밝히는데 널리 사용되고 있다. 저자는 신경생리학적 동물실험에 많이 쓰이고 있는 기법으로서 정위법, 병소만들기, 전기적 자극, 측정 및 기록, 조직학적 부위 확인 등 일연의 과정에 대해 간략히 설명하였다. 그러나 이러한 연구의 결과는 신경화학적 연구, 기능을 점검해 볼 수 있는 행동학적 연구로서 보완이 될 때에 믿을만한 결론을 도출해 낼 수 있을 것으로 생각된다.