Korean Journal of Biological Psychiatry

Advances in molecular biology contribute to the understanding genetic mechanism of psychiatric disorders. They have renewed hope for the discovery of disease relevant gene. However, the results somewhat confused. And we will wait for a long time for the application of gene therapy in schizophreniar. Fortunately we could classified the schizophrenia with genotypes of dopamine and serotonin receptors. It is expected that this genetic classification could provide key strategy for the therapeutic application in biological treatment for schizophrenia. The purpose of this article is to call attention of the institute participants to linkage, association, mRNA expression, genotypic classification and to the need for more systemic research. The author summarized the modified methods which were done in his laboratory in appendix.

Keywords Schizophrenia;Linkage;Association;mRNA expression;Genotypic classification;Therapeutic application.

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□부 록□
말초 혈액으로부터 genomic DNA의 정제
1. 시약 및 기구
ACE shocking solution
NH 4Cl 8g,
Na 2EDTA H 2O 1g,
KH 2PO 4 0.1g
；make up 1 liter, check that the pH is between 6.8
-7.2 and filter sterilze
Nuclei Lysis Buffer
Tris(pH 8.0) 10mM,
NaCl 400mM,
EDTA 2mM
；make up 1 liter, and filter sterilze
Saturated NaCl
10% SDS
Proteinase K (20mg/ml)
Microfuge (refrigerated)
Heat block
2. 방 법
1) 혈액 1.5ml을 13,000rpm에서 1분간 원심분리하여 serum을 제거한다.
2) 남은 pellet에 ACE shocking solution을 500㎕ 넣고 서서히 3분간 흔들어준다.
3) 1번, 2번 과정을 2회 반복한다.
4) 상층액을 깨끗이 제거한 후 남은 pellet에 400㎕의 Nuclei lysis Buffer를 넣고 pellet을 잘 섞어준다.
5) 10% SDS 30㎕와 proteinase K 10㎕를 첨가하고 56℃에서 2시간동안 반응시킨다.
6) Saturated NaCl 140㎕를 넣고 상온에서 15분간 방치한다.
7) 13,000rpm에서 1분간 원심분리한 후 상층액을 새 tube에 옮긴다.
8) 2 배 부피의 에탄올을 넣고, 침전된 DNA를 회수하여 새 tube에 옮긴다.
9) 침전된 DNA를 70% 에탄올로 세척한 후 건조시킨다.
10) 건조된 DNA를 멸균된 증류수 50㎕에 녹인다.
11) 정제한 DNA를 0.8% agarose gel에서 전기영동하여 확인한다.
DNA 농도측정：fluorometer 이용
1. 시약 및 기구
10X TNE 100mM Tris (12.11g)
10mM EDTA (3.72g)
2M NaCl (116.89g)
H3328
Dye solution A 10X TNE 10ml
dw 90ml
H3328 10㎕
Calf thymus DNA
calf thymus DNA (1mg/ml) 100㎕
10X TNE 100㎕
DW 800㎕
2. 방 법
1) 미리 fluorometer를 warm up 시켜놓는다
2) Dye A 2ml넣어 영점 맞춘다
3) calf 2㎕ 넣고 scale 100으로 맞춘다.
4) Dye A 2ml에 sample DNA 2㎕넣어 농도를 측정한다
Gel electrophoresis
1. 시약 및 기구
1) Agarose gel
50X TAE 242g Tris base
57.1ml glacial acetic acid
100ml 0.5M EDTA(pH 8.0)
Agarose
2) Acrylamide gel
5X TBE 54g Tris base
27.5g boric acid
20ml 0.5M EDTA(pH8.0)
30% Acrylamide 29g acrylamide
1g polyacryamide
total 100ml dw 넣고 약간 가열하여 녹인후 filtration 한다.
10% APS
TEMED
EtBr 10mg/ml stock solution을 희석해서 쓴다.
loading dye 0 .25% bromophenol blue (0.075g)
0.25% xylene cyanol FF (0.075g)
15% Ficoll (4.5g) / 30ml
ladder Gibco ladder (μg/㎕) 50㎕
loading dye 100㎕
dw 450㎕
분주해둔다
2. 방법
1) Gel을 만든다.
Agarose gel은 1X TAE buffer 이용 (2% gel) Acrylamide gel 은 0.5X TBE buffer 이용 (5% gel)
5X TBE 6ml
30% Acrylamide 10ml
dw 44ml
APS 200㎕
TEMED 100㎕
2) gel이 완전히 굳은후 30분가량 100V에서 running 한다.
3) EtBr staining 10-20분 한다.
4) Transilluminator에서 확인한다.
Polymerase Chain Reaction
1. 시약 및 기구
Primer (10 pmol / ㎕)；
Template DNA
10mM dNTP mixture
10X Taq polymerase buffer：
500mM KCl
100mM Tris HCl (pH 9.0, 25℃)
1.0 % Triton X-100
25mM MgCl 2
PCR machine
2. 방 법
1) PCR은 극소량의 DNA contamination에도 민감하므로 조심하여 수행한다.2) 0.5ml microfuge tube에 PCR 반응의 component들을 섞는다.
Template DNA 50ng
Primer 25pmole
MgCl 2 1.5mM
10X reaction buffer 5㎕
dGTP, dCTP, dTTP, dATP 200 μM
Taq polymerase 1U
；up to 50㎕ with H 2O
3) Mineral oil을 20㎕ 넣는다.
4) Thermal reactor의 tube rack을 면봉으로 잘 닦고 mineral oil을 한 두 방울 떨어뜨린다.
5) Program을 입력하고 실행한다.
94℃ 4분
68℃ 1분
72℃ 1분
에서 1 cycle
94℃ 1분
68℃ 1분
72℃ 1분
에서 9 cycle
90℃ 30초
68℃ 1분
72℃ 30초
에서 30 cycle을 수행하고,
final extention으로 72℃에서 10분을 수행한다.
6) Polyacrylamide gel electrophoresis：amplification 여부를 확인하기 위하여, 10% polyacrylamide gel에 반응액 10 ㎕를 6X loading dye와 섞어 loading하여 전기영동을 수행한다. BPB가 거의 바닥에 닿을 만큼 이동하면 전기영동을 끝내고 staining하여 transilluminator에서 확인한다.
Silver sequencing
1. 시약 및 기구
Promega kit Q4130 이용.
1) Ladder sequencing
① 0.5ml microcentrifuge tube 4개에 각각 G, A, T, C 2㎕씩 넣는다.
② 새 tube에
Template DNA (pZEM pUC. 4㎕
DNA sequencing buffer 5㎕
pUC/M13 Forward Primer 3.6㎕
dw 3.4㎕
Taq polymerase 1㎕
넣고 가볍게 mixing 한다.
③ 위 ② mix를 ①에서 준비한 tube에 각각 4㎕ 씩 넣는다.
④ PCR 돌린다. (file #12)
2) Plate 준비
① Gel판을 10% NaOH에 overnight 시켜 깨끗이 제거한후 씻어말린다.
② EtOH로 long glass short glass를 닦아준다.
③ Short glass 에 bind siline solution 1ml을 떨어뜨린후 주의해서 wipe
bind siline solution bind siline 300㎕
EtOH 95ml
Acetic acid 5ml
④ Long glass 에는 sigma coat 1ml 떨어뜨리고 wipe
⑤ 5분 drying 후 EtOH로 닦아준다.
⑥ Glass 사이에 spacer 꽂고 집게로 고정
⑦ 6% sequencing gel
40% acrylamide 380g acrylamide
20g bisacrylamide/1l 14.99ml
5X TBE 20ml
8M urea 48g
dw 15ml
100ml/heat
약 50ml와 APS 35∼40㎕ TEMED 200㎕ 섞어 spacer 꽂아둔 glass에 부어준다.
⑧ Gle 굳으면 1X TBE 부어주고 sample loading
⑨ 2500V에서 5시간 running
3) Silver staining
① Gel 판을 분리한후 fix/stop solution (200ml acetic acid + 1800ml dw)에서 20분
② Dw washing 3분간 3회반복
③ Staining solution에서 30분
silver nitrate 2g
37% Formaldehyde 3ml
ddw 2l
④ 미리 냉장시킨 developing solution 5분이내.
Sodium carbonate 60g
37% Formaldehyde 3ml 사용직전 넣어준다.
Sodium thiosulfate 400㎕ 사용직전 넣어준다.
ddw 2l
어느정도 band 보이면 fix/stop solution을 부어준다.
⑤ dw로 washing후 건조시킨다.
4) Exposed APC film
① Gel이 완전히 말랐는지 확인한다.
② Light box 위에 gel판을 올려 놓고 safe light만 켠다.
③ Film을 coating 부분이 아래로 향하게 gel 위에 올린다
④ Light box on하여 30초 정도 감광시킨다.
⑤ Off 한 후 film을 developing solution에 담근다. 상이 나타날때까지
⑥ Dw로 washing
⑦ Film을 fixing solution에 담근다. 3분
⑧ Dw로 washing
Sequencing
1. Dideoxy-mediated Sequencing reactions using Sequenase
1) 시 약
Univeral forward primer：0.3 pmol/㎕ (● 2ng/㎕)
ss DNA template：0.1∼0.5μg/㎕
Stock labeling mixture
dGTP (0.5mM)
dCTP (0.5mM)
dTTP (0.5mM)
[α- 35S] dATP：(600Ci/mmol；10mCi/ml in water)
Chain-extension/chain-termination mixtures
5X Sequenase buffer
0.1M DTT
Water bath：37℃, 65℃
2) 방 법
① 다음과 같은 components를 epp. tube에 섞는다.
Primer (0.5 pmol) 2.5㎕
5 X Sequenase buffer 2.0㎕
ss DNA template 2㎕ (●1μg)
H 2O 3.5㎕
② Denaturation and annealing：
이 mixture를 65℃에서 2분간 incubation 한 후, 상온이 될 때까지 방치하여 template와 primer를 annealing 시킨다.
③ A nnealing 되는 동안 labeling mix를 5배, Sequenase를 7배 희석시킨다.
④ Annealing이 끝난 후 새 epp. tube에 아래의 용액을 섞고 상온에서 2분간 reaction 시킨다.
Template/primer 10㎕
DTT 1㎕
Labeling mix 2㎕
[α- 35S] dATP 1㎕
Sequenase 2㎕
⑤ 미리 준비된 termination mix tube(ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)에 위에서 반응시킨 용액을 4㎕씩 넣고 37℃에서 5분간 반응시킨다.
⑥ 반응이 끝난후 reaction stop solution을 4㎕씩 넣는다.
2. Denaturing Polyacylamide Gel Electrophoresis
1) 시약 및 기구
40% Acrylamide solution
acyrlamide (DNA-sequencing grade) 380g
N, N'-methylenebisacrylamide 20g
distilled H2O to 600ml
10XTBE
Urea
10% Ammonium persulfate (APS)
TEMED(N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine)
Sequencer
Power supplier(2000V)
Coating solution
2) 방 법
① 아래와 같은 조성으로 6% acrylamide/urea gel monomer 용액을 만든다.
40% acrylamide 15ml
10X TBE 10ml
Urea 46g
distilled H2O to 100 ml
；filter the solution through a nitrocellulose filter (0.45 micron pore size)이 monomer solution 에 APS 와 TEMED를 첨가한다.
② Casting the gel
Glass plate를 잘 닦은 후, 한쪽 plate만 coating solution으로 coating 한다. 이 plate를 assembe 한 후, 90도 각도로 세워서 acrylamide solution을 붓고, comb를 꽂는다.
Acrylamide monomer solution을 30분에서 1시간동안 polymerize 시킨다.
③ Gel이 굳은후 sequencing sample 1∼2㎕을 loading 한다
④ 이 gel을 1500V에서 3∼4시간동안 running 시킨다.
⑤ Running이 끝난후 gel을 3MM paper에 붙인 후 gel dryer로 말린다.
⑥ 말린 gel을 cassette에 넣고 X-ray film에 2∼3일간 exposure 시킨다.
⑦ X-ray film을 현상하여 sequence를 읽는다.
Total RNA의 정제
1. 시약 및 기구
Guanidium homogenizer Buffer
4M guanidium thiocyanate
5mM sodium acetate (pH 5.2)
0.15mM dithiothreitol
0.5% sodium lauryl sarcosinate
Acid phenol
Chloroform
Homogenizer
2. 방 법
1) Cell pellet(또는 Tissue)에 5 volume의 guanidium homogenizer Buffer를 넣고 glass/teflon homogenizer로 cell을 lysis 시킨다.
2) 이 homogenized된 cell suspension에 동일 volume의 acid phenol을 넣고 vortexing 한다.
3) 이 용액에 다시 chloroform을 total volume의 1/2 volume을 넣고 vorexing하여 완전히 섞어준다.
4) 이 용액을 4℃에서 12,000rmp으로 20 분 동안 원심분리하여 유기용매층과 수용액층을 분리한다.
5) 상층액을 취하여 1/2 volume의 chloloform을 첨가하여 4)번 과정과 동일한 조건에서 원심분리한다.
6) 상층액을 취한후, LiCl 1/10 volume 가하고, -20℃에 1 시간정도 보관한 다음, 위와 같은 조건으로 원심분리한다.
7) 원심분리해서 생성된 pellet을 70% ethanol로 washing 한 후 건조한다
8) 건조된 RNA 를 DEPC 로 처리된 증류수에 녹인다.
Northern hybridization
1. Electrophoresis of RNA through agarose gel containing formaldehyde
1) 시약 및 기구
RNA
10X formaldehyde gel running buffer ：
0.2M MOPS (pH 7.0)
80mM sodium acetate
10mM EDTA
Agarose
Ethidium bromide
Formaldehyde gel-loading buffer ：
50% glycerol
1mM EDTA
0.25% Bromophenol blue
0.25% Xylene cyanol FF
Agarose gel electrophoresis kit
UV transilluminater
2) 방 법
① 다음과 같이 1.2% denaturating agarose gel을 만든다.
Agarose 1.65g
ddH 2O 119.50ml
이들을 microwave oven에서 녹이고, 60℃로 식으면
10X formaldehyde gel running buffer 13.75ml
formaldehyde 4.10ml
을 가한다.
② Gel이 응고되는 동안 loading할 sample은 다음과 같은 조건으로 준비한다.
RNA 4.5㎕
10X formaldehye gel running buffer 1.0㎕
Formaldehye 3.5㎕
Formamide 10.0㎕
이 sample을 65℃에서 15분간 incubation한 후 ice에서 냉각시키다.
③ Sample을 loading 하기전에 5V/cm로 5분간 prerunning하고, 2) 에서 준비한 sample에 Formaldehye gel-loading buffer를 2㎕를 가하고 gel에 loading 한다.
④ 이 gel을 1X formaldehye gel running buffer에서 3∼4 V/cm로 running 한다.
2. Hybridization
1) 시약 및 기구
Nylon membrane (positively charged)
3MM paper(Whatman)
Transfer buffer(20X SSC)：NaCl, 3M；Sodium citrate, 0.3M, pH 7.0)
Hybridization buffer：5X SSC, 2% blocking reagent, 50% formamide, 0.1% N-lauroylsarcosine ,
SDS 0.02%
UV crosslinker
Hybridization incubator
Vacuum transfer unit
2) 방 법
① Electrophoresis후 사진을 찍고, gel의 불필요한 부분은 잘라낸다.
② Nylon membrane으로 transfer 하기 전에 gel 20X SSC(DEPC treated)로 15분간 2번 equilibration 시킨다.
③ V acuum transfer the RNA to Nylon membrane from agarose gel
Vacuum을 10cm/Hg로 조절한다.
Gel이 마르지 않도록 transfer solution을 부어주면서 1∼3시간동안 transfer를 수행한다.
④ RNA fixation：filter를 UV crosslinker로 link 시킨다.
⑤ Labeling of probe：DIG oligonucleotide 3’-End labeling kit를 이용한다.
a) Ice상에서 reaction component들을 혼합한다.
4㎕ 5×tailing buffer,
4㎕ CoCl 2 solution,
100 pmol oligonucleotide,
1㎕ DIG-ddUTP solution,
1㎕ (약 50 units) terminal transferase.
b) 37℃에서 1시간 정도 반응시킨다.
c) Termination mix(1㎕ glycogen solution, 200㎕ of EDTA 0.2M)를 가한다.
d) Ethanol precipitation：2.5㎕의 4M LiCl와 75㎕의 냉각된(-20℃) ethanol을 첨가하여 잘 섞은 후 -70℃에서 30 분간 방치한다. 원심분리(13,000rpm, 10분) 후 70% ethanol 50㎕를 넣어 washing 한다.
e) Probe DNA pellet 을 공기 중에서 말린 후 증류수 10㎕에 녹인다.
f) -20℃에 보관한다.
⑥ Prehybridization
H ybridization buffer 20ml / 100cm 2 filter를 hybridiz a-tion bottle에 넣고 hybridization과 같은 온도에서 membrane을 precoating 시킨다(probe가 작을 경우는 생략 가능).
⑦ Hybridization
68℃에서 2.5∼3시간 hybridization을 수행한다. (Hybridizer 이용)；Hybridization buffer의 양은 2.5ml / 100 cm 2 filter로 한다.
⑧ Washing
a) 상온에서 0.1% SDS를 포함하는 2×SSC solution 50ml로 서서히 흔들어주면서 5분 정도 washing 한다. b) Washing solution을 교체한 후 다시 5분 정도 washing 한다.
c) 0.5% SDS를 포함하는 0.1×SSC로 5분 정도 washing 한다.
3. Chemiluminescent detection and autoradiography
1) 시약 및 기구
Red rotor
37℃ incubator
X-ray film & cassette
Plastic 용기
Buffer 1：
Maleic acid, 0.1M
NaCl, 0.15M
；adjusted pH to 7.5(20℃) with NaOH；autoclaved
Blocking stock solution：
Blocking reagent, 10%(w/v), in buffer 1；autoclaved and stored at 4℃
Buffer 2：2% blocking reagent in buffer 1
Washing buffer：buffer 1 + Tween-20, 0.3%(w/v)
Buffer 3：
Tris-HCl, 0.1M
NaCl, 0.1M
MgCl 2, 50mM
Adjusted pH to 9.5(20℃) with NaOH
Lumigen PPD substrate solution：
0.1mg/ml in buffer 3
2) 방법
① Membrane을 Washing buffer로 5분간 washing 한다.
② Blocking：buffer 2(100ml / 100cm 2 filter)에 30분간 방치한다.
③ Antibody binding：diluted antibody conjugate solution(75mU/ml in buffer 2)에 30분 정도 반응시킨다.
④ Washing：unbound conjugate를 제거하기 위하여 washing buffer(100ml / 100cm 2 filter)로 15분씩 2번 washing 한다.
⑤ Equlibration：buffer 3(20ml/100cm 2 filter)으로 5분간 반응시킨다.
⑥ Membrane을 substrate인 Lumigen PPD solution(0.1 mg/ml)에 넣어 5분정도 반응시킨다.
⑦ 물기를 어느정도 제거한 후(마른 3MM paper에 blotting), 젖은 membrane을 37℃에서 10분간 preincubation 한다.
⑧ 상온에서 15∼25분 정도 X-ray film에 노출시킨다.
DRD1 Methods
1. Genomic DNA의 정제
말초 혈액 1.5ml를 13,000rpm에서 1분간 원심분리하여 혈청을 제거하고, 남은 pellet에 ACE shocking solution(NH4Cl 8g, Na2EDTAH2O 1g, KH2PO4 0.1g을 증류수 1ℓ에 녹인 용액)을 500㎕을 넣고 서서히 3분간 흔들어 적혈구를 제거한다. 상기 과정을 2회 반복한다.
상층막을 깨끗이 제거한 후 남은 pellet에 400㎕의 nucleic lysis Buffer[Tris(pH 8.0) 10mM, NaCl 400mM, EDTA 2 mM]를 넣고 pellet을 잘 섞어준다. 여기에 10% SDS 27㎕와 proteinase K 10㎕를 첨가하고 56℃에서 2시간 동안 반응시키고 saturated NaCl 135㎕를 넣고 상온에서 15분간 방치한다. 13000rpm에서 1분간 원심분리한후 상층액을 새 관에 옮긴 후 2배 부피의 에탄올에 넣고 침전된 DNA를 회수하여 새 관에 옮긴다. 이 DNA를 70% 에탄올로 세척한 후 건조시키고, 증류수 100㎕에 녹인다.
2. 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction：PCR)을 이용한 유전자형의 판별
도파민 D1 수용체 유전자에서 다형성(Polymorphism)을 보이는 부위에 대해 중합효소 연쇄반응을 시행하였으며 도파민 D1 수용체 유전자좌를 분석하기 위해 사용한 시발체의 염기배열순서는 다음과 같다.
Forward
5’-ACTGACCCCTATTCCCTGCT-3’
Reverse
5’-AGCACAGACCAGCGTGTTC-3’
PCR은 25㎕의 반응용량으로 35주기를 수행하였고 반응조건은 다음과 같다.
Taq pol buffer 50mM KCl/10mM TrisCl(pH 8.3)
MgCl2 1.5mM
Each Primer each 20pmol/25㎕
dNTP 200μM
Taq polymerase 3U
Template DNA 200ng
25㎕
반 응온도와 시간은 94℃에서 10분간 1주기를 수행한 후 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초간 각각 35주기를 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 10분간 1주기를 수행하였다.
3. 증폭된 생성물의 분석
B1절편과 B2절편을 구별하기 위해 PCR 생성물을 DdeI제한효소로 절단하고 2% 한천 겔에서 전기영동한 후 ethidium bromide 용액으로 염색하여 자외선 투사기(ultraviolet trans illuminator)에서 관찰하고 polaroid 카메라(polaroid, film 667)로 촬영하였다.
4. Determination of PCR products
Size of product：207bp
Cutting with DdeI：Allele B1-146bp 61bp
B2-146bp 42bp 19bp
참고문헌
Sven C, Markus MN, Jeanette E, Peter P(1994)：Detection of four polymorphic sites in the human dopamine D1 receptor gene(DRD1). Human Molecular Genetics 3(1)：209
DRD2 Methods
1. Genomic DNA의 정제
말초 혈액 1.5ml를 13,000rpm에서 1분간 원심분리하여 혈청을 제거하고, 남은 pellet에 ACE shocking solution(NH4Cl 8g, Na2EDTAH2O 1g, KH2PO4 0.1g을 증류수 1ℓ에 녹인 용액)을 500㎕을 넣고 서서히 3분간 흔들어 적혈구를 제거한다. 상기 과정을 2회 반복한다.
상층막을 깨끗이 제거한 후 남은 pellet에 400㎕의 nucleic lysis Buffer[Tris(pH 8.0) 10mM, NaCl 400mM, EDTA 2mM]를 넣고 pellet을 잘 섞어준다. 여기에 10% SDS 27㎕와 proteinase K 10㎕를 첨가하고 56℃에서 2시간 동안 반응시키고 saturated NaCl 135㎕를 넣고 상온에서 15분간 방치한다. 13000rpm에서 1분간 원심분리한후 상층액을 새 관에 옮긴 후 2배 부피의 에탄올에 넣고 침전된 DNA를 회수하여 새 관에 옮긴다. 이 DNA를 70% 에탄올로 세척한 후 건조시키고, 증류수 100㎕에 녹인다.
2. 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction：PCR)을 이용한 유전자형의 판별
도파민 D2 수용체 유전자에서 다형성(Polymorphism)을 보이는 부위에 대해 중합효소연쇄반응을 시행하였으며 도파민 D2 수용체 유전자좌를 분석하기 위해 사용한 시발체의 염기배열순서는 다음과 같다.
Forward
5’-CCGTCGACGGCTGGCGAAGTTGTCTA-3’
Reverse
5’-CCGTCGACCCTTCCTGAGTGTCATCA-3’
PCR은 25㎕의 반응용량으로 35주기를 수행하였고 반응조건은 다음과 같다.
Taq pol buffer 50mM KCl/10mM TrisCl(pH 8.3)
MgCl2 1.5mM
Each Primer Each 20pmol/25㎕
dNTP 200μM
Taq polymerase 3U
Template DNA 200ng
25㎕
반응온도와 시간은 94℃에서 10분간 1주기를 수행한 후 94 ℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분30초간 각각 35주기를 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 10분간 1주기를 수행하였다.
3. 증폭된 생성물의 분석
A1절편과 A2절편을 구별하기 위해 PCR 생성물을 TaqI제한효소로 절단하고 2% 한천 겔에서 전기영동한 후 ethidium bromide 용액으로 염색하여 자외선 투사기(ultraviolet trans illuminator)에서 관찰하고 polaroid 카메라(polaroid, film 667)로 촬영하였다.
4. Determination of PCR product
Size of product：310bp
Cutting with TaqI：Allele A1-310bp
Allele A2-180bp 130bp
참고문헌
Grandy DK, Zhang Y, Civelli O(1993)：PCR detection of the TaqA RFLP at the DRD2 locus. Human Molecular Genetics 2(12)：2197
DRD3 Methods
1. Genomic DNA의 정제
말초 혈액 1.5ml를 13,000rpm에서 1분간 원심분리하여 혈청을 제거하고, 남은 pellet에 ACE shocking solution(NH4Cl 8g, Na2EDTAH2O 1g, KH2PO4 0.1g을 증류수 1ℓ에 녹인 용액)을 500㎕을 넣고 서서히 3분간 흔들어 적혈구를 제거한다. 상기 과정을 2회 반복한다.
상층막을 깨끗이 제거한 후 남은 pellet에 400㎕의 nucleic lysis Buffer[Tris(pH 8.0) 10mM, NaCl 400mM, EDTA 2mM]를 넣고 pellet을 잘 섞어준다. 여기에 10% SDS 27㎕와 proteinase K 10㎕를 첨가하고 56℃에서 2시간 동안 반응시키고 saturated NaCl 135㎕를 넣고 상온에서 15분간 방치한다. 13000rpm에서 1분간 원심분리한후 상층액을 새 관에 옮긴 후 2배 부피의 에탄올에 넣고 침전된 DNA를 회수하여 새 관에 옮긴다. 이 DNA를 70% 에탄올로 세척한 후 건조시키고, 증류수 100㎕에 녹인다.
2. 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction：PCR)을 이용한 유전자형의 판별
도파민 D3 수용체 유전자에서 다형성 (Polymorphism)을 보이는 부위에 대해 중합효소연쇄반응을 시행하였으며 도파민 D3 수용체 유전자좌를 분석하기 위해 사용한 시발체의 염기배열순서는 다음과 같다.
Forward
5’-GCTCTATCTCCAACTCTCACA-3’
Reverse
5’-AAGTCTACTCACCTCCAGGTA-3’
PCR은 25㎕의 반응용량으로 35주기를 수행하였고 반응조건은 다음과 같다.
Taq pol buffer 50mM KCl/10mM TrisCl(pH 8.3)
MgCl2 1.5mM
Each Primer each 20pmol/25㎕
dNTP 200μM
Taq polymerase 3U
Template DNA 200ng
25㎕
반응온도와 시간은 94℃에서 10분간 1주기를 수행한 후 94 ℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분간 각각 35주기를 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 10분간 1주기를 수행하였다.
3. 증폭된 생성물의 분석
A1절편과 A2절편을 구별하기 위해 PCR 생성물을 MluI 제한효소로 절단하고 2% 한천 겔에서 전기영동한 후 ethidium bromide 용액으로 염색하여 자외선 투사기(ultraviolet tran silluminator)에서 관찰하고 polaroid 카메라(polaroid, film 667)로 촬영하였다.
4. Determination of PCR product
Size of product：304bp
Cutting with TaqI：Allele 1-314bp
Allele 2-206bp 98bp
참고문헌
Corcq MA, Mant R, Asher son P, Willinms J, Hode Y, Mayerova A, Collier D, Lannfelt L, Sodoloff P, Schwartz JC, Gill M, Macher JP, Mcguffin P, Owen MJ(1992)：Association between schizophrenia and homozygosity at the dopamine D3 receptor gene. J Med Genet 29：858-860
DRD4 Methods
1. Genomic DNA의 정제
말초 혈액 1.5ml를 13,000rpm에서 1분간 원심분리하여 혈청을 제거하고, 남은 pellet에 ACE shocking solution(NH4Cl 8g, Na2EDTAH2O 1g, KH2PO4 0.1g을 증류수 1ℓ에 녹인 용액)을 500㎕을 넣고 서서히 3분간 흔들어 적혈구를 제거한다. 상기 과정을 2회 반복한다.
상층막을 깨끗이 제거한 후 남은 pellet에 400㎕의 nucleic lysis Buffer[Tris(pH 8.0) 10mM, NaCl 400mM, EDTA 2mM]를 넣고 pellet을 잘 섞어준다. 여기에 10% SDS 27㎕와 proteinase K 10㎕를 첨가하고 56℃에서 2시간 동안 반응시키고 saturated NaCl 135㎕를 넣고 상온에서 15분간 방치한다. 13000rpm에서 1분간 원심분리한후 상층액을 새 관에 옮긴 후 2배 부피의 에탄올에 넣고 침전된 DNA를 회수하여 새 관에 옮긴다. 이 DNA를 70% 에탄올로 세척한 후 건조시키고, 증류수 100㎕에 녹인다.
2. 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction：PCR)을 이용한 유전자형의 판별
도파민 D4 수용체 유전자에서 다형성(Polymorphism)을 보이는 부위에 대해 중합효소연쇄반응을 시행하였으며 도파민 D4 수용체 유전자좌를 분석하기 위해 사용한 시발체의 염기배열순서는 다음과 같다.
Sense
5’-GCTGCTGCTCTACTGGGC-3’
Antisense
5’-GTGCACCACGAAGAAGGG-3’
PCR은 50㎕의 반응용량으로 35주기를 수행하였고 반응조건은 다음과 같다.
Taq pol buffer 50mM KCl/10mM TrisCl(pH 8.3)
MgCl2 1.5mM
Each Primer each 20pmol/25㎕
dNTP 200μM
Taq polymerase 3U
Template DNA 200ng
50㎕
반응온도와 시간은 94℃에서 5분간 1주기를 수행한 후 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 72℃에서 30초간 각각 35주기를 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 5분간 1주기를 수행하였다.
3. 증폭된 생성물의 분석
도파민 수용체인 DRD4유전자에 나타나는 48bp 반복서열을 분석하기 위해 5% poly acrylamide 겔에서 전기영동한 후 ethidium bromide 용액으로 염색하여 자외선 투사기(ultravi olet transilluminator)에서 관찰하고 polaroid 카메라(polaroid, film 667)로 촬영하였다.
4. Determination of PCR product
Size of product：520bp 570bp 620bp 670bp 720bp 760bp
참고문헌
Shaikh S, Collier D, Kerwin RW, Pilowsky LS, Gill M, Xu WM, Thornton A(1993)：Dopamine D4 receptor subtypes and response to clozapine. Lancet 341：116
DRD5 Methods
1. Genomic DNA의 정제
말초 혈액 1.5ml를 13,000rpm에서 1분간 원심분리하여 혈청을 제거하고, 남은 pellet에 ACE shocking solution(NH4Cl 8g, Na2EDTAH2O 1g, KH2PO4 0.1g을 증류수 1ℓ에 녹인 용액)을 500㎕을 넣고 서서히 3분간 흔들어 적혈구를 제거한다. 상기 과정을 2회 반복한다.
상층막을 깨끗이 제거한 후 남은 pellet에 400㎕의 nucleic lysis Buffer[Tris(pH 8.0) 10mM, NaCl 400mM, EDTA 2mM]를 넣고 pellet을 잘 섞어준다. 여기에 10% SDS 27㎕와 proteinase K 10㎕를 첨가하고 56℃에서 2시간 동안 반응시키고 saturated NaCl 135㎕를 넣고 상온에서 15분간 방치한다. 13000rpm에서 1분간 원심분리한후 상층액을 새 관에 옮긴 후 2배 부피의 에탄올에 넣고 침전된 DNA를 회수하여 새 관에 옮긴다. 이 DNA를 70% 에탄올로 세척한 후 건조시키고, 증류수 100㎕에 녹인다.
2. 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction：PCR)을 이용한 유전자형의 판별
1) DRD5-microsatellite(D5(CT/GT/GA)n)
도파민 수용체인 DRD5 유전자 D5(CT/GT/GA)n 부위에대해 중합효소 연쇄반응을 시행하였다.
DRD5 유전자 D5(CT/GT/GA)n를 분석하기에 사용된 시발체 염기 배열 순서는 다음과 같다.
5’-CGTGTATGATCCCTGCAG-3’
5’-GCTCATGAGAAGAATGGAGTG-3’
PCR은 50㎕의 반응용량으로 35주기를 수행하였고 반응조건은 다음과 같다.
Taq pol buffer 50mM KCl/10mM TrisCl(pH 8.3)
MgCl2 1.5mM
Each Primer each 10pmol/50㎕
dNTP 200μM
Taq polymerase 2.5U
Template DNA 100ng
50㎕
반응온도와 시간은 94℃에서 5분간 1주기를 수행한 후 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초간 각각 35주기를 수행하였고 마지막으로 72℃에서 10분간 1주기를 수행하였다.
2) DRD5-exonic polymorphism
도파민 수용체인 DRD5 유전자의 exon에 위치한 mutation(Pro 326：CCT→CCC)을 분석하기위해 그 유전자 부위에 대해 중합효소 연쇄반응을 시행하였다.
DRD5 유전자를 분석하기에 사용된 시발체 염기 배열 순서는 다음과 같다.
A：5’-CCGGAGGGCCTTCG-3’
B：5’-CCGGAGGGCCTTCA-3’
C：5’-CCTGGGAGGAGGACT-3’
PCR은 50㎕의 반응용량으로 35주기를 수행하였고 반응조건은 다음과 같다.
Taq pol buffer 50mM KCl/10mM TrisCl(pH 8.3)
MgCl2 1.5mM
Each Primer 0.1μM
dNTP 200μM
DMSO 10%(w/w)
Taq polymerase 0.5unit
Template DNA 100ng
50㎕
반응온도와 시간은 94℃에서 5분간 1주기를 수행한 후 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 30초간 각각 35주기를 수행하였고 마지막으로 72℃에서 10분간 1주기를 수행하였다.
3. 증폭된 생성물의 분석
1) DRD5-microsatellite(D5(CT/GT/GA)n)
DRD5 유전자 D5(CT/GT/GA)n의 경우, PCR을 통해 증폭된 DNA들은 대립유전자에따라 2∼24bp정도의 차이를 보이는데, 이를 구별하기 위해서 6% urea polyacrylamide seque ncing gel에 전기 영동이 요구된다. 즉, 증폭된 DNA들은 sequencing loading dye와 섞은 후, 1분간 끓여 변성시킨후 sequencing gel에 loading한다. 이후 1500V에서 8시간 동안 전기영동을 수행하고 전기영동이 끝나면 은염색(silver staining)을 통해 절편을 확인한 후 PCR에 의해 증폭된 DNA를 pUC 19 ladder와 비교하여 정확한 길이를 분석한다.
2) DRD5-exonic polymorphism
도파민 수용체인 DRD5 유전자의 exon에 위치한 mutation(Pro 326：CCT→CCC)을 분석하기 위해 allelespecific amplication(PASA)을 이용한다. Primer A와 C에 의해 증폭된 절편은 a2(C 대립유전자)이며 Primer B와 C에 의해 증폭된 절편은 a1(T 대립유전자)으로 이를 구별하기 위하여 5% polyacrylamide gel에서 전기영동한 후 ethidium bromide 용액으로 염색하여 자외선 투과기(ultraviolet transillu-minator)에서 관찰하고 polaroid 카메라(polaroid, film 667)로 촬영한다.
참고문헌
Steve SS, Janet LS, Leonard L, Heston(1993)：A common exonic polymorphism in the human D5 dopamine recertor receptor gene, 92：633-634
5-HT2A(5-hydroxytryptamine type 2a) Receptor Gene Methods
1. Genomic DNA의 정제
말초 혈액 1.5ml를 13,000rpm에서 1분간 원심분리하여 혈청을 제거하고, 남은 pellet에 ACE shocking solution(NH4Cl 8g, Na2EDTAH2O 1g, KH2PO4 0.1g을 증류수 1ℓ에 녹인 용액)을 500㎕을 넣고 서서히 3분간 흔들어 적혈구를 제거한다. 상기 과정을 2회 반복한다.
상층막을 깨끗이 제거한 후 남은 pellet에 400㎕의 nucleic lysis Buffer[Tris(pH 8.0) 10mM, NaCl 400mM, EDTA 2mM]를 넣고 pellet을 잘 섞어준다. 여기에 10% SDS 27㎕와 proteinase K 10㎕를 첨가하고 56℃에서 2시간 동안 반응시키고 saturated NaCl 135㎕를 넣고 상온에서 15분간 방치한다. 13000rpm에서 1분간 원심분리한후 상층액을 새 관에 옮긴 후 2배 부피의 에탄올에 넣고 침전된 DNA를 회수하여 새 관에 옮긴다. 이 DNA를 70% 에탄올로 세척한 후 건조시키고, 증류수 100㎕에 녹인다.
2. 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction：PCR)을 이용한 유전자형의 판별
세로토닌 수용체인 5-hydroxytryptamine type 2a 유전자의 nucleotide -24에서 318 부위에 대해 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
세로토닌 수용체인 5-hydroxytryptamine type 2a 유전자를 분석하기에 사용된 시발체 염기 배열 순서는 다음과 같다.
5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGTCTGCTACAAGTTCTGGCTT-3’
5’-CTGCAGCTTTTTCTCTAGGG-3’
PCR은 50㎕의 반응용량으로 3주기와 35주기를 수행하였고 반응조건은 다음과 같다.
Taq pol buffer 50mM KCl/10mM TrisCl(pH 8.3)
MgCl2 1.5mM
Each Primer each 20pmol/50㎕
dNTP 200μM
Taq polymerase 3U
Template DNA 200ng
50㎕
반응온도와 시간은 94℃에서 3분, 60℃에서 45초, 72℃에서 1.5분간 3주기를 수행한 후 94℃에서 1분, 60℃에서 45초, 72 ℃에서 1.5분간 각각 35주기를 수행하였다.
3. 증폭된 생성물의 분석
세로토닌 수용체인 5-hydroxytryptamine type 2a 유전자에 위치한 mutation(TCT→TCC：102)을 분석하기위해 PCR 생성물(372bp)을 MspI 제한효소로 절단한다. 이를 구별하기 위하여 5% polyacrylamide gel에서 전기영동한 후 ethidium bromide 용액으로 염색하여 자외선 투과기(ultraviolet transilluminator)에서 관찰하고 polaroid 카메라(polaroid, film 667)로 촬영한다.
4. Determination of PCR product
Size of product：372bp
Cutting with MspI：Allele 1-372bp
Allele 2-216bp 156bp
참고문헌
Warren JT, Peacock ML, Rodfiguez LC, Fink JK(1993)：An MspI polymorphism in the human serotonin receptor gene(HTR2)：detection by DGGE and RFLP analysis. Humane Molecular Genetics 2(3)：338
Interleukin 2 Receptor β(IL-2Rβ)Gene Methods
1. Genomic DNA의 정제
말초 혈액 1.5ml를 13,000rpm에서 1분간 원심분리하여 혈청을 제거하고, 남은 pellet에 ACE shocking solution(NH4Cl 8g, Na2EDTAH2O 1g, KH2PO4 0.1g을 증류수 1ℓ에 녹인 용액)을 500㎕을 넣고 서서히 3분간 흔들어 적혈구를 제거한다. 상기 과정을 2회 반복한다.
상층막을 깨끗이 제거한 후 남은 pellet에 400㎕의 nucleic lysis Buffer[Tris(pH 8.0) 10mM, NaCl 400mM, EDTA 2mM]를 넣고 pellet을 잘 섞어준다. 여기에 10% SDS 27㎕와 proteinase K 10㎕를 첨가하고 56℃에서 2시간 동안 반응시키고 saturated NaCl 135㎕를 넣고 상온에서 15분간 방치한다. 13000rpm에서 1분간 원심분리한후 상층액을 새 관에 옮긴 후 2배 부피의 에탄올에 넣고 침전된 DNA를 회수하여 새 관에 옮긴다. 이 DNA를 70% 에탄올로 세척한 후 건조시키고, 증류수 100㎕에 녹인다.
2. 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction：PCR)을 이용한 유전자형의 판별
Interleukin 2 receptor β gene의 dinucleotide repeat인 (GT)n 부위에 대해 중합효소 연쇄반응을 시행하였다.
Interleukin 2 receptor β gene의 dinucleotide repeat인 (GT)n를 분석하기에 사용된 시발체 염기 배열 순서는 다음과 같다.
5’-GAGAGGGAGGGCCTGCGTTC-3’
5’-CACCCAGGGCCAGATAAAGA-3
PCR은 50㎕의 반응용량으로 35주기를 수행하였고 반응조건은 다음과 같다.
Taq pol buffer 50mM KCl/10mM TrisCl(pH 8.3)
MgCl2 1.5mM
Each Primer each 10pmol/50㎕
dNTP 200μM
Taq polymerase 2.5U
Formamide 5%
Template DNA 200ng
50㎕
반응온도와 시간은 94℃에서 5분간 1주기를 수행한 후 94℃에서 20초, 60℃에서 20초, 72℃에서 30초간 각각 25주기를 수행하였다.
3. 증폭된 생성물의 분석
Interleukin 2 receptor β gene의 dinucleotide repeat인 (GT)n의 경우, PCR을 통해 증폭된 DNA(대략 153bp)들은 대립유전자에 따라 2∼16bp 정도의 차이를 보이는데, 이를 구별하기 위해서 6% urea polyacrylamide sequencing gel에 전기 영동이 요구된다. 즉, 증폭된 DNA들은 sequencing loading dye와 섞은 후, 1분간 끓여 변성시킨후 sequencing gel에 loading한다. 이후 1500V에서 8시간 동안 전기영동을 수행하고 전기영동이 끝나면 은염색(silver staining)을 통해 절편을 확인한 후 PCR에 의해 증폭된 DNA를 pUC 19 ladder와 비교하여 정확한 길이를 분석한다.
4. Determination of PCR product
Size of product：149bp-163bp
Allele1 149 Allele2 151 Allele3 153 Allele4 155
Allele5 157 Allele6 159 Allele7 161 Allele8 163
참고문헌
Eric SB, Miles BB, Henrik V(1993)：Dunucleotide repeat polymorphism in the IL-2Rβ gene. Nucleic Acids Research 19(14)：4022
Interleukin 2 Gene Methods
1. Genomic DNA의 정제
말초 혈액 1.5ml를 13,000rpm에서 1분간 원심분리하여 혈청을 제거하고, 남은 pellet에 ACE shocking solution(NH4Cl 8g, Na2EDTAH2O 1g, KH2PO4 0.1g을 증류수 1ℓ에 녹인 용액)을 500㎕을 넣고 서서히 3분간 흔들어 적혈구를 제거한다. 상기 과정을 2회 반복한다.
상층막을 깨끗이 제거한 후 남은 pellet에 400㎕의 nucleic lysis Buffer[Tris(pH 8.0) 10mM, NaCl 400mM, EDTA 2mM]를 넣고 pellet을 잘 섞어준다. 여기에 10% SDS 27㎕와 proteinase K 10㎕를 첨가하고 56℃에서 2시간 동안 반응시키고 saturated NaCl 135㎕를 넣고 상온에서 15분간 방치한다. 13000rpm에서 1분간 원심분리한후 상층액을 새 관에 옮긴 후 2배 부피의 에탄올에 넣고 침전된 DNA를 회수하여 새 관에 옮긴다. 이 DNA를 70% 에탄올로 세척한 후 건조시키고, 증류수 100㎕에 녹인다.
2. 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction：PCR)을 이용한 유전자형의 판별 Interleukin 2 gene의 simple repeat인 (CA)n(CT)n 부위에 대해 중합효소 연쇄반응을 시행하였다.
분석에 사용된 시발체 염기 배열 순서는 다음과 같다.
5’-AAA GAG ACC TGC TAA CAC A-3’
5’-CCT ATG TTG GAG ATG TTT AT-3’
PCR은 50㎕의 반응용량으로 35주기를 수행하였고 반응조건은 다음과 같다.
Taq pol buffer 50mM KCl/10mM TrisCl(pH 8.3)
MgCl2 1.5mM
each Primer each 10pmol/50㎕
dNTP 200μM
Taq polymerase 2.5U
Formamide 5%
Template DNA 200ng
50㎕
반응온도와 시간은 94℃에서 3분간 1주기를 수행한 후 94℃에서 20초, 60℃에서 20초, 72℃에서 30초간 각각 25주기를 수행하였다.
3. 증폭된 생성물의 분석
Interleukin 2 gene의 simple repeat인 (CA)n(CT)n의 경우, PCR을 통해 증폭된 DNA들은 대립유전자에따라 2∼32 bp정도의 차이를 보이는데, 이를 구별하기 위해서 6% urea polyacrylamide sequencing gel에 전기 영동이 요구된다. 즉, 증폭된 DNA들은 sequencing loading dye와 섞은 후, 1분간 끓여 변성시킨후 sequencing gel에 loading한다. 이후 1500V에서 8시간 동안 전기영동을 수행하고 전기영동이 끝나면 은염색(silver staining)을 통해 절편을 확인한 후 PCR에 의해 증폭된 DNA를 pUC 19 ladder와 비교하여 정확한 길이를 분
석한다.
4. Determination of PCR product
Size of PCR product：115bp-147bp
A1 147bp A2 145bp A3 143bp A4 141bp A5 139bp
A6 137bp A7 135bp A8 133bp A9 131bp A10 129bp
A11 127bp A12 125bp A13 123bp A14 119bp A15 115bp
참고문헌
Eppien C, Frank M, Nagy M, Nurnberg P, Eppien JT(1994)：Di-nucleotide repeat polymorphism in the IL2 and IL5RA genes. Human Molecular Genetics 3：679
MAO A
1. Genomic DNA의 정제
말초 혈액 1.5ml를 13,000rpm에서 1분간 원심분리하여 혈청을 제거하고, 남은 pellet에 ACE shocking solution(NH4Cl 8g, Na2EDTAH2O 1g, KH2PO4 0.1g을 증류수 1ℓ에 녹인 용액)을 500㎕을 넣고 서서히 3분간 흔들어 적혈구를 제거한다. 상기 과정을 2회 반복한다.
상층막을 깨끗이 제거한 후 남은 pellet에 400㎕의 nucleic lysis Buffer[Tris(pH 8.0) 10mM, NaCl 400mM, EDTA 2mM]를 넣고 pellet을 잘 섞어준다. 여기에 10% SDS 27㎕와 proteinase K 10㎕를 첨가하고 56℃에서 2시간 동안 반응시키고 saturated NaCl 135㎕를 넣고 상온에서 15분간 방치한다. 13000rpm에서 1분간 원심분리한후 상층액을 새 관에 옮긴 후 2배 부피의 에탄올에 넣고 침전된 DNA를 회수하여 새 관에 옮긴다. 이 DNA를 70% 에탄올로 세척한 후 건조시키고, 증류수 100㎕에 녹인다.
2. 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction：PCR)을 이용한 유전자형의 판별
Monoamine oxidase A 유전자에서 다형성(Polymorphism)을 보이는 부위에 대해 중합효소연쇄반응을 시행하였으며 사용한 시발체의 염기배열순서는 다음과 같다.
Sense
5’-TTA AAT GGT CTC GGG AAG G-3’
Antisense
5’-GCC CAA TGA CAC AGC CTT T-3’
PCR은 25㎕의 반응용량으로 35주기를 수행하였고 반응조건은 다음과 같다. Taq pol buffer 50mM KCl/10mM TrisCl(pH 8.3)
MgCl2 1.5mM
Each Primer each 20pmol/25㎕
dNTP 200μM
Taq polymerase 3U
Template DNA 200ng
25㎕
반응온도와 시간은 94℃에서 10분간 1주기를 수행한 후 94℃에서 30초, 55℃에서 1분, 72℃에서 30초간 각각 35주기를 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 10분간 1주기를 수행하였다.
3. 증폭된 생성물의 분석
A1절편과 A2절편을 구별하기 위해 PCR 생성물을 EcoRV제한효소로 절단하고 2% 한천 겔에서 전기영동한 후 ethidium bromide 용액으로 염색하여 자외선 투사기(ultraviolet transilluminator)에서 관찰하고 polaroid 카메라(polaroid, film 667)로 촬영하였다.
4. Determination of PCR Products
Size of product：488bp
Cutting with EcoRV：Allele A1-488bp
A2-456bp 32bp
참고문헌
Beatrice C, Dominique C, Florence T, Sonia D, Philippe P, Sophie L, Thierry V, Viviane M, Cosette M, Francoise C, Claudine L, Jacques M, Michel P, Thierry F(1996)：Association study between schizophrenia and monoamine oxidase A and B DNA polymorphisms. Psychiatry Research 62：221-226
D5S39 D5S76 Locus Methods
1. Genomic DNA의 정제
말초 혈액 1.5ml를 13,000rpm에서 1분간 원심분리하여 혈청을 제거하고, 남은 pellet에 ACE shocking solution(NH4Cl 8g, Na2EDTAH2O 1g, KH2PO4 0.1g을 증류수 1ℓ에 녹인 용액)을 500㎕을 넣고 서서히 3분간 흔들어 적혈구를 제거한다. 상기 과정을 2회 반복한다.
상층막을 깨끗이 제거한 후 남은 pellet에 400㎕의 nucleic lysis Buffer[Tris(pH 8.0) 10mM, NaCl 400mM, EDTA 2mM]를 넣고 pellet을 잘 섞어준다. 여기에 10% SDS 27㎕와 proteinase K 10㎕를 첨가하고 56℃에서 2시간 동안 반응시키고 saturated NaCl 135㎕를 넣고 상온에서 15분간 방치한다. 13000rpm에서 1분간 원심분리한후 상층액을 새 관에 옮긴 후 2배 부피의 에탄올에 넣고 침전된 DNA를 회수하여 새 관에 옮긴다. 이 DNA를 70% 에탄올로 세척한 후 건조시키고, 증류수 100㎕에 녹인다.
2. 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction：PCR)을 이용한 유전자형의 판별
도파민 D1 수용체 유전자에서 다형성(Polymorphism)을 보이는 부위에 대해 중합효소연쇄반응을 시행하였으며 도파민 D1 수용체 유전자좌를 분석하기 위해 사용한 시발체의 염기배열순서는 다음과 같다.
1) D5S39
5’- CCATTGTATTAGGGTTCTCCAG-3’
5’- CTCTTGGTTTCCTGGCTTCGG-3’
PCR은 25㎕의 반응용량으로 30주기를 수행하였고 반응조건은 다음과 같다.
Taq pol buffer 50mM KCl/10mM TrisCl(pH 8.3)
MgCl2 1.5mM
Each Primer each 20pmol/25㎕
dNTP 200μM
Taq polymerase 3U
Template DNA 200ng
25㎕
반응온도와 시간은 94℃에서 10분간 1주기를 수행한 후 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 30초간 각각 35주기를 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 10분간 1주기를 수행하였다.
2) D5S76
5’-CAG TCC TCG TGG AAT CAT GC-3’
5’-TAT TTG CAC TTA TTT ACT GCT CC-3’
PCR은 25㎕의 반응용량으로 30주기를 수행하였고 반응조건은 다음과 같다.
Taq pol buffer 50mM KCl/10mM TrisCl(pH 8.3)
MgCl2 1.5mM
Each Primer each 20pmol/25㎕
dNTP 200μM
Taq polymerase 3U
Template DNA 200ng
25㎕
반응온도와 시간은 94℃에서 10분간 1주기를 수행한 후 94 ℃에서 1분, 57℃에서 1분, 72℃에서 30초간 각각 35주기를 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 10분간 1주기를 수행하였다.
3. 증폭된 생성물의 분석
D5S39 D5S76의 경우 PCR을 통해 증폭된 DNA들은 대립유전자형에 따라 2∼10bp 정도의 차이를 보이는데 이것을 구별하기 위해 PCR 생성물을 6% urea polyacrylamide sequencing gel에 전기영동이 요구된다. 즉, 증폭된 DNA들은 sequencing loading dye 와 섞은 후, 1분간 끓여 변성시킨 후 sequencing gel에 loading한다. 이후 1500V에서 8시간 동안 전기영동을 수행하고 전기영동이 끝나면 은염색(silver staining)을 통해 절편을 확인한 후 PCR에 증폭된 DNA를 pUC 19 ladder와 비교하여 정확한 길이를 분석한다.
4. Determination of PCR products
Size of product：D5S39-218bp 222bp 224bp 226bp
230bp
D5S76-94bp 102bp 108bp 112bp
참고문헌
Sherrington R, Mankoo B, Dixon M, Curtis D, Kalsi G, Melmer G, Gufling H(1993)：Microsatellite polymorphism for chromosome 5 bands q11.2-13.3. Hum Hered 43：197-202