Korean Journal of Biological Psychiatry

서론
세로토닌계 이상과 정신 질환과의 연관성에 대해 많은 연구보고가 있어왔다. 특히 정신분열병 환자에서 여러 가지 형태의 세로토닌계의 이상이 관찰되면서 세로토닌-도파민 가설이 제기되기도 하였다(Meltzer 1989). 정신분열병 환자의 사후 뇌연구에서는 전전두엽 부위에서 5-HT2A 수용체와 일부 변연계에서 5-HT 2 수용체와 5-HT 1A 수용체의 밀도 감소가 관찰되어 전전두엽 부위에서 세로토닌 결핍과 피질하 부위에서의 세로토닌 과다가 정신분열병의 원인이라는 가설이 제기되고 있다(Breier 1995；Dean과 Hayes 1996). 5-HT2A 수용체 길항제가 치료저항성 정신분열병에 효과적이라는 점에서 세로토닌 수용체는 관심의 대상이 되고 있다. 현재까지 세로토닌 수용체는 5-HT 1에서 5-HT 4까지 4개의 수용체가 알려져 있고 이중 5-HT2A(Chen등 1992；Saltzman등 1991), 5-HT 2B(Choi등 1994；Kursar등 1994；Schmuk등 1994), 5-HT 2C(Saltzman등 1991) 등 세 개의 세로토닌 수용체의 유전자가 클론닝되었다. 5-HT2A 수용체 유전자의 위치는 염색체 13q14-q21로 알려져 있으며(Chen등 1992；Hsieh등 1990；Saltzman등 1991), 13번 염색체의 몇몇 유전적 표식자들이 정신분열병의 병인과 연관되었을 가능성이 보고되었다(Lin등 1995). 몇몇 연구들(Erdmann등 1996；Inayam등 1996；Williams등 1996)에서 5-HT2A 수용체 유전자의 T102C 다형성과 정신분열증과의 관련성을 보고하면서, 세로토닌 수용체 유전자를 정신분열병의 병인에 관여하는 후보 유전자로 제시하였다. 그러나 몇몇 다른 연구에서는 5-HT2A 수용체 유전자의 T102C 다형성과 정신분열병과의 관련성이 없다는 사실이 보고되어(Hallmayer등 1992；Hawi등 1997；Verga등 1997), 아직까지 일치된 결과를 얻지 못하고 있다. 따라서 본 연구에서는 한국인 정신분열병 환자에서 5-HT2A 수용체 유전자의 T102C 다형성이 정신분열병과의 관련성이 있는지에 대해 알아보고자 하였다.
연구대상 및 방법
1. 연구대상
본 연구는 DSM-Ⅳ 진단 기준에 부합된 정신분열병 환자 127명을 대상으로 하였으며, 다른 정신과적 질환이나 내외과적 병력이 있는 환자들은 제외하였다.
2. 연구방법
1) Genomic DNA의 정제
말초 혈액 1.5ml를 13,000rpm에서 1분간 원심분리하여 혈청을 제거하고, 남은 pellet에 ACE shocking solution(NH 4Cl 8 g, Na 2EDTAH2O 1g, KH 2PO 4 0.1g을 증류수 1l에 녹인 용액)을 500μl 넣고 서서히 3분간 흔들어 적혈구를 제거한다. 상기 과정을 2회 반복한다.
상층막을 깨끗이 제거한 후 남은 pellet에 400μl의 nucleic lysis Buffer[ Tris(pH 8.0) 10mM, NaCl 400mM, EDTA 2 mM]를 넣고 pellet을 잘 섞어준다. 여기에 10% SDS 27μl와 proteinase K 10μl를 첨가하고 56℃에서 2시간 동안 반응시키고 saturated NaCl 135μl을 넣고 상온에서 15분간 방치한다. 13000rpm에서 1분간 원심분리한후 상층액을 새 관에 옮긴 후 2배 부피의 에탄올에 넣고 침전된 DNA를 회수하여 새 관에 옮긴다. 이 DNA를 70% 에탄올로 세척한 후 건조시키고, 증류수 100μl에 녹인다.
2) 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction：PCR)을 이용한 유전자형의 판별
세로토닌 수용체인 5-hydroxytryptamine type 2A 유전자의 nucleotide-24에서 318 부위에 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 세로토닌 수용체인 5-hydroxytryptamine type 2A 유전자를 분석하기 위해 시발체 염기배열순서는 다음과 같다.
Forward
5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGTCTGCTACAAGTTCTGGCTT-3'
Backward
5'-CTGCAGCTTTTTCTCTAGGG-3'
PCR은 50μl의 반응용량으로 3주기와 35주기를 수행하였고 반응조건은 다음과 같다.
Taq pol buffer 50mM KCl/10mM TrisCl(pH 8.3)
MgCl 2 1.5mM
Each Primer each 20pmol/50μl
dNTP 200μM
Taq polymerase 3U
Template DNA 200ng
50㎕
반응속도와 시간은 94℃에서 3분, 60℃에서 45초, 72℃에서 1분 30초간 3주기를 수행한 후 94℃에서 1분, 60℃에서 45초, 72℃에서 1분 30초간 각각 35주기를 수행하였다.
3) 증폭된 생성물의 분석
세로토닌 수용체인 5-hydroxytryptamine type 2A 유전자에 위치한 변이(TCT → TCC：102)을 분석하기 위해 PCR 생성물(372bp)을 MspI제한효소로 절단한다. 이를 구별하기 위하여 5% polyacrylamide gel에서 전기영동한 후 ethidium bromide 용액으로 염색하여 자외선 투사기(ultraviolet transilluminator)에서 관찰하고 폴라로이드 카메라(polaroid, film 667)로 촬영하였다.
4) Determination of PCR product
Size of product：372bp
Cutting with TaqI： Allele 1 - 372bp
Allele 2 - 216bp, 156bp
3. 통계학적 분석
정신분열병 환자군과 정상대조군에 따른 두 집단간의의 빈도 차이가 있는지 χ2-test를 통해 분석하였다. 또한 Hardy-We-inberg equilibrium에 따른 대립유전자의 분포를 알아보기 위해 χ2-test를 시행하였다. 통계적 유의성은 p<.005 이내로 하였다.
결과
정상 대조군의 평균 연령은 38.06±11.46세 이었고, 이중 남성은 63명, 여성은 37명이었으며, 정신분열병 환자군의 평균 연령은 35.97±7.81세 이었고, 이중 남성은 81명, 여성은 46명이었다(표 1). 127명의 정신분열병 환자군과 100명의 정상 대조군에서 5-HT2A 수용체 유전자의 T102C 다형성의 분포는 다양하게 분포되었다(그림 1). 전체 대상군에서 C1C1, C1C2, C2C2 유전자형을 나타낸 경우가 각각 59명(26%), 106명(46.7%), 62 명(27.3%)이었다. 정상 대조군에서 나타난 C1C1, C1C2, C2C2 유전자형의 분포는 각각 26명, 44명, 30명이었으며, 정신분열병 환자군은 33명, 62명, 32명으로 두 군사이 통계적으로 유의한 차이는 보이지 않았다(χ2＝.751, df＝2, p＝.687)(표 2).
고찰
5-HT2A 수용체 유전자가 정신분열병의 후보 유전자로 제시한 몇몇 연구들이 있었다(Erdmann등 1996；Inayam등 1996；Williams등 1996).
5-HT2A 수용체 유전자 부위에서는 Tsr25Asn, His452Tyr, 102T/C, 516C/T 등 4개의 변이가 관찰된다. 이중 두 개의 변이(Tsr25Asn, His452Ty)는 아미노산 서열을 변화시키지만, 다른 두개의 변이(102T/C, 516C/T)는 아미노산 서열을 바꾸지 않는 비기능성 다형성을 나타낸다(Erdmann등 1996).
Erdmann등(1996)은 정신분열병 환자들에서 Tsr25Asn, His452Tyr, 102T/C, 516C/T 등 4개의 5-HT2A variant의 분포를 조사하였을 때, 비기능성 다형성을 나타내는 102T/C에서만 정상대조군에 비해 정신분열병 환자들에서 유의하게 높은 빈도를 관찰하였다. 따라서 5-HT2A 수용체 유전자의 T102C 다형성은 아미노산의 서열을 바꾸지 않아 단백질의 구조나 발현에 영향을 주지 않으므로 T102C 다형성과 linkage disequilibrium을 이루는 functional 5-HT2A receptor variant와 정신분열병의 관련성을 제시하였다.
Williams등(1996)은 5-HT2A 수용체 유전자의 T102C 다형성과 정신분열병의 관련성을 보고하면서 정신분열병의 병인에 관여하는 T102C 다형성의 몇 가지 역할을 제시하였다. 첫번째 역할은 T102C 다형성이 정신분열병의 발생에 직접적인 원인은 아니지만, 정신분열병의 원인 유전자와 linkage disequilibrium을 형성할 가능성이다. 두 번째 역할은 T102C 다형성이 5-HT2A 수용체 유전자의 mRNA의 구조와 안정성에 영향을 주는 전사 단계(translation stage)에서 작용을 할 가능성이다. 또 하나의 역할은 아미노산의 구조에 영향을 주는 두 개의 mutation(102T/C, 516C/T)의 대립유전자 분포가 정신분열병과 정상 대조군에서 차이가 없으므로(Burnet과 Harrison 1995), 정신분열병의 발생에 관여하는 유전자는 promotor regions이나 regulatory regions에 위치할 가능성이다.
그러나 한국인 정신분열병 환자들을 대상으로 5-HT2A 수용체 유전자의 T102C 다형성의 유전자형과 대립유전자의 빈도를 조사한 본 연구에서는 정신분열병 환자군과 정상 대조군 사이에 유의한 차이가 없었다. 이는 5-HT2A 수용체 유전자의 T102C 다형성과 정신분열증과의 관련성이 없음이 보고된 다른 몇몇 연구들(Hallmayer등 1992；Hawi등 1997；Verga등 1997)의 결과와 일치한다.
정신분열병과 5-HT2A 수용체 유전자의 T102C 다형성의 관계에 관한 본 연구와 이전의 다른 연구들에서 결과의 일치를 보지 못하고 있는 점은 대립 유전자의 빈도가 인종간에 차이가 많아 발생하는 population stratification, 정신분열병의 유전적 이질성(genetic heterogeneity), 원인론적 분류가 아닌 임상적 현상학에 따른 분류, 그리고 유전형 투과도의 불완전성(incomplete penetrance) 등으로 인해 발생하여 해석의 오류가 있을 수 있다. 따라서 향후 추가적인 연구가 더 필요하다.