Korean Journal of Biological Psychiatry

서론
계획된 세포사망(programmed cell death)은 일명 세포사망(apoptosis)이라 하며, 형태학적으로나 생화학적으로 세포괴사(necrosis)와 구별될 수 있는 특이한 세포의 죽음으로써, 정상적인 환경에서는 다세포 생물의 항상성(homeostasis) 유지에 관여한다. 생물체내에서 비정상적으로 세포사망 속도가 증가하면 몇몇 퇴행성 질병의 병인으로 작용하고, 반대로 그 속도가 감소하면 자가면역 질환과 암 질환 등의 병인으로 작용한다(Thompson 1995).
신경계에 관련된 많은 질환들은 신경세포들이 죽고 나면 기존에 존재하는 세포에 의해서 새로운 신경세포들이 다시 만들어지지 않기 때문에 일단 질환이 진행되고 나면 치료하기가 매우 어렵다. 신경세포의 세포사망 기전에 대한 연구로는 신경성장인자(nerve growth factor；이하 NGF)의 고갈(Martin등 1988；Edwards등 1991)과 뇌국소빈혈(Heron등 1993；Linnik등 1993；MacManus등 1993), kainate에 의한 경련, 부신제거와 같은 병인적인 환경에 의한 연구가 많이 이루어지고 있다(Dessi등 1995；Sanz-Rodriguez등 1997).
Cytosine arabinoside(이하 AraC)는 DNA 합성과 DNA 수선에 관련된 β-DNA 중합효소의 작용을 억제함으로써(Kufe와 Major 1982；Fram과 Kufe 1985) mitotic 세포를 죽이기 때문에 백혈병의 암 화학요법제로 사용되어져 왔다. 그러나, 고농도의 AraC(≥24×10 3mg/m 2)를 처방받은 백혈병 환자들의 15%에서 뇌병증, 경련, 및 백질뇌병증 등과 같은 신경계에 작용하는 부작용들이 관찰되었다(Lazarus등 1981；Hwang등 1985). 그 후, AraC가 postmitotic 신경세포에 어떤 기전을 통해 영향을 미치는지에 대한 연구가 활발히 수행되어져 왔다. Wallace와 Johnson의 연구(1989)에 의하면 교감신경세포에서 AraC에 의해 세포사망이 유도되었고, 이는 2'-deoxycytidine에 의해서 저해되었다. 그러나, adenine arabinoside, thymine arabinoside, 5-fluorodeoxyuridine, 5-bromodeoxycytide, 5-azadeoxycytide와 aphidicolin과 같은 세포분열억제제에 의해서는 세포사망이 전혀 유도되지 않았다. 이는 AraC가 postmitotic 신경세포에서 DNA 합성과 수선에 전혀 상관없는 2'-deoxycytidine 의존 기전을 저해함으로써 세포사망을 유도시키는 것으로 추정하게 한다(Wallace와 Johnson 1989).
Dessi등(1995)의 연구에 의하면 배양된 소뇌신경세포에서도 AraC에 의해 세포사망이 유도되었고, 2'-deoxycytidine, 단백질과 RNA합성 저해제에 의해 세포사망이 저해되었다. 이때, AraC에 의한 소뇌신경세포의 세포사망 과정에서 미지의 특정 단백질이 과다 발현되었으나, 발현된 단백질의 정체는 밝혀지지 않았다. 대부분의 세포들에서 일어나는 세포사망 과정에 caspase 계통에 속하는 단백질 가수분해 효소(Kumar 1995)나 CrmA이나 Bcl-2등과 같은 저해제가 관여함이 밝혀지면서 AraC에 의한 세포사망 경로가 관심을 가지게 되었다. 이미 PC12 세포에서 NGF의 고갈에 의해 유도된 세포사망 기전에 caspase-1(interleukin-1β-converting enzyme；이하 ICE)이 관련됨이 보고된 바 있다(Troy등 1996). 또한, 본 연구실에서 에탄올의 산화성 스트레스에 의한 세포사망 기전의 저해에 Bcl-2가 관여함을 규명하였다(임은정 등 1997).
본 연구에서는 AraC에 의해 유도된 postmitotic 신경세포의 세포사망 기전이 어떠한 경로로 이루어지는 가를 규명하고자 하였다. 특히, NGF로 처리하였을 경우 mitotic 상태에서 postmitotic 상태로 전환되면서 교감신경세포와 비슷한 특성을 보이는 PC12 세포로 AraC에 의한 세포사망 기전 중에 caspase-1/caspase-3 단백질 가수분해 효소가 관여하는지에 대한 연구를 수행하였다.
재료 및 방법
1. 실험재료
1) PCR primer 제작
Caspase를 위한 중합효소연쇄반응(PCR) 시발체(primer)는 다음과 같이 고안하여 합성하였다. 생쥐 ICE(Nett 등, 1992)와 Nedd2(Kumar등 1994) primer는 이미 발표되어진 cDNA 염기서열을 가지고 제작되어진 것이고, CPP32 primer는 Alnemri 박사(Thomas Jefferson University)에 의해 제공된 cDNA 염기서열을 가지고 제작되어진 것이다.
Casepase-1(ICE) primer set；
5'primer：5'-acacgycttgccctcattatctgca-3'(25 mer)
3'primer：5'-tgtcagaagtcttgtgctctggg-3'(23 mer)
Casepase-3(CPP32) primer set；
5'primer：5'-gagcactggaatgtc-3'(15 mer)
3'primer：5'-atgaagagtttcggc-3'(15 mer)
Casepase-2(Nedd2) primer set；
5'primer：5'-attcagcacgtactc-3'(15 mer)
3'primer：5'-tagagtagtgtggtc-3'(15 mer)
2) 사용 시약
RPMI1640, Dulbecco's modified eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), horse serum과 penicillin-streptomycin은 GIBCO BRL사(Gaithersburg, U.S.A.)에서 구입하였고, trypan blue, MTT(3-[4,5-dimethyltiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; thiazolyl blue), NGF와 AraC는 Sigma사(Missouri, U.S.A)에서 구입하였다. RNAzol TM 용액은 Biotec Laboratories사(Texas, U.S.A.)로부터, random hexamer는 Boehringer Mannheim사(Mannheim, Germany)로부터 구입하였으며, dNTP, RNAsin, 및 MMLV 역전사 효소는 Promega사(Wisconsin, U.S.A.)제품을 사용하였다. Taq DNA polymerase는 Perkin Elmer사에서, Caspase인 ICE, CPP32 그리고 Nedd2 시발체는 SCL사(Seoul, Korea)에서 주문 합성하여 사용하였다. Caspase-1(ICE) 기질인 Tyr-Val-Ala-Asp-pNA(ρ-nitroanilide)와 caspase-3(CPP32)의 기질인 Asp-Glu-Val-Asp-pNA(ρ-nitroanilide)는 Biomol(PA, U.S.A.)에서 구입하였고, 그 이외의 시약들은 Merck사(Darmstadt, Germany)로부터 구입하였다.
2. 실험방법
1) PC12 세포배양
PC12 세포는 American Type Culture Collection에서 구입하였고, 세포주의 배양은 Greene과 Tischler의 방법(1976)에 의해 RPMI1640 배지에 10% horse serum과 5% FBS를 첨가하여 배양하였다. PC12 세포를 postmitotic 신경세포로 분화시키기 위해서 0.05μg/ml NGF(nerve growth factor)가 첨가된 RPMI1640 배양액을 사용하였고, 배양용기는 poly-L-lysine으로 coating되어진 것을 사용하였다.
2) AraC 처리
PC12세포에 0.05 μg/ml NGF를 첨가하고 10일 배양시킨 후, AraC를 0, 12.5, 25, 50, 100 및 300 μM되게 처리하여 배양하였고, 필요에 따라 3∼5일 정도 배양을 지속하였다.
3) MTT 분석
MTT 분석은 Mosmann의 방법(1983)을 일부 변형하여 사용하였다. 200 μl당 10 5 세포들을 배양한 96 well plate에 2.5 mg/ml MTT 용액 10 μl를 첨가하고 37℃에서 2시간동안 배양하였다. 그 후, 96 well plate에서 배양액을 조심스럽게 제거하고 isopropanol에 녹인 0.04 M HCl 100 μl를 넣었다. 상온에서 청색의 formazan 결정을 녹인 후, ELISA reader로 595nm에서 흡광도를 측정하였다.
4) Genomic DNA 분절화 확인
변형된 Gross-Bellard등의 방법(1973)을 사용하여 DNA를 추출하였다. 다양한 배양 조건에서 배양된 세포를 2000×g로 10분간 원심분리한 다음 1.5ml microtube로 옮겨 PBS(pH 7.2)로 3회 세척하였다. 500μl의 lysis 완충용액(100 mM NaCl, 10 mM Tri·HCl, pH 8.0, 25 mM EDTA, pH 8.0, 0.5% (w/v) SDS 및 0.1 mg/ml proteinase K)로 세포를 용해한 다음, 37 ℃에서 하룻밤 반응시킨 후 동일 량의 페놀/클로로포름 용액으로 2회 추출하여 단백질을 제거하였다. 여기에 ammonium acetate를 최종 농도가 1 M이 되게 처리하고 동일 량의 2-isopropanol을 첨가하여 15,000×g에서 15분간 침전시켰다. 이때 얻어진 침전물을 70% ethanol로 세척하고 건조한 다음 20μl의 멸균 증류수로 녹였다. 여기에 RNase A를 최종 농도 1mg/ml이 되게 처리하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 65℃에서 RNase A를 불활성화시킨 다음 1μg/ml의 ethidium bromide가 들어 있는 1.5% 아가로스 겔에서 전기 영동을 하였다.
5) 역전사 연쇄중합반응(RT-PCR)
(1) RNA 추출
6 well plate에서 배양된 세포에 RNAzol TM 1ml을 넣고 세포를 파괴하였다. Lysate를 1.5ml microtube에 넣고 12,000×g에서 15 분 동안 원심분리하여 상층액을 새 tube에 옮겼다. 여기에 동량의 2-isopropanol을 넣고 얼음에 30 분간 둔 다음, 12,000×g에서 15분에서 원심분리하였다. 현탁액을 제거하고 침전된 RNA를 75% 에탄올에 세척하고 건조시킨 후에 DEPC로 처리된 3차 증류수에 녹였다.
(2) cDNA 합성
추출한 전체 RNA 1 μg을 DEPC로 처리된 물로 희석시켜 70∼80℃에서 3분 동안 반응시키고 1∼2초 동안 원심분리하여 얼음에 두었다. 여기에 3.3μM random hexamer, 반응완충액, 0.5mM dNTP, 1 U/ml RNasin, 13.3 U/μl MMLV 역전사 효소를 첨가하여 총 부피 30μl가 되는 반응물을 만들어 42℃에서 1시간 동안 반응시켜 cDNA합성을 하였다. 그후 70∼80℃에서 10분간 처리하여 cDNA 합성반응을 중단시켰다.
(3) PCR
PCR반응은 cDNA 1μl를 1mM PCR primer, PCR 완충용액, 80μM dNTP, 1.25 UTaq DNA polymerase가 들어간 혼합물에 첨가하여 총 부피 20 μl를 94℃ 에서 1분, 55℃에서 1 분, 72℃에서 1분으로 35 사이클의 반응을 진행시켰다. PCR결과물을 1.5%의 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다.
6) Caspase-1와 caspase-3의 활성도 측정
(1) 세포질 추출액 조제
Srinivasan등의 방법(1996)을 사용하여 세포질 추출액을 조제하였다. 100mm plate에 배양한 세포를 PBS로 2번 세척한 다음 추출완충액[100mM HEPES, pH 7.5, 1% Triton X-100, 100 mM DTT, 1mM EDTA, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 50μg/ml leupeptin, 1μg/ml pepstatin A]로 세포를 파괴하였다. 파괴된 세포를 얼음에서 30분 동안 두면서 2초씩 4번 섞어 준 다음, 20,000×g에서 15분 동안 원심분리하여 세포질 추출액을 얻었다.
(2) 단백질 정량
단백질 정량은 Lowry등의 방법(1951)을 사용하였다. 먼저 stock reagents로 1% copper sulphate (A), 2% sodium potassium tartrate (B), 0.2 M sodium hydroxide (C), 그리고 4% sodium carbonate (D)를 준비하였다. 이 중 solution C와 D를 각각 49ml씩, 그리고 solution A와 B를 1ml씩 섞어 copper-alkali 용액을 만들었다. 세포질 추출액을 100μl씩 준비하여 테스트 튜브에 넣고 증류수를 가해 최종 부피를 1ml로 맞춘 뒤 2.5ml의 copper-alkali 용액을 가해 10분간 상온에 방치한 다음 Folin-Ciocalteau reagent 0.25ml을 가하여 잘 섞어준 후, 30분간 상온에서 반응하였다. 이를 750nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 정량을 하였다. 표준 단백질로는 소의 혈청알부민을 사용하였다.
(3) ICE 및 CPP32 활성도 측정
ICE 및 CPP32 활성도 측정은 Srinivasin등의 방법(1996)을 변형하여 사용하였다. 즉, 600μg 세포질 추출액을 ICE 표준 완충액[100mM HEPES-KOH buffer, pH 7.5, 10% sucrose, 0.1% CHAPS, 10μM DTT, 0.1mg/ml ovalbumin]에 희석하여 총 부피 0.6ml 되게 만든 다음, 100μM ICE 기질(YVAD-pNA) 또는 CPP32 기질(DEVD-pNA)을 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 이를 400nm에서 흡광도로 측정하였다.
결과
1. PC12 세포의 형태와 viability 변화
10% horse serum과 5% FBS가 첨가된 RPMI1640 배양액에서 배양된 정상적인 PC12 세포는 세포분열을 수행하여 성장 상태를 유지하였다. 농도별로 AraC를 처리하여 1일 동안 반응시켜본 결과 세포형태 변화는 거의 없었고, 세포 viability 역시 70∼80%정도로 큰 변화는 없었다. AraC를 2일 동안 반응시켜 본 결과 고농도 AraC를 처리해 준 세포일수록 세포막이 크게 손상되어 세포형태가 크게 변화되었고, 세포 viability 역시 30% 정도로 급격히 감소하였다(Fig. 1A, B, Fig. 2).
PC12 세포를 0.05μg/ml NGF가 첨가된 RPMI1640 배양액에 약 10일 정도 배양한 결과 post-mitotic 상태로 전환되면서 신경세포의 형태를 나타냈다. AraC를 농도별로 처리하여 1일 동안 반응시켜본 결과 세포 형태의 변화는 거의 없었고, 2일 동안 반응시켰을 경우에도 역시 세포 형태에는 큰 변화는 없었다(Fig. 1C, D).
또한, neuronal PC12 세포는 AraC를 농도별로 처리하여 1일 동안 반응시켰을 경우 세포 viability는 대조군과 차이를 나타내지 않았으나, 2일부터 세포 viability 변화를 나타냈다. AraC의 농도를 100μM로 처리하여 2일 동안 반응시켰을 경우 세포 viability는 약 60%로 감소하였고, 3일 동안 반응시켰을 경우는 약 50%로 감소하였다(자료 미제시).
2. PC12 세포의 DNA 분절화
AarC를 농도별로 처리하여 1일과 2일 동안 반응시켜 DNA 분절화를 관찰한 결과 AraC를 300μM까지 처리하였을 경우 정상적인 PC12 세포에서는 DNA의 분절화가 전혀 일어나지 않았다. 즉, 임파구 세포사망 과정시 일어나는 전형적인 180∼200 bps 차이의 DNA ladder는 관찰되지 않았다(Fig. 3). AraC를 농도별로 처리하여 1일과 2일 동안 반응시킨 신경성의 PC12 세포에서 DNA 분절화를 관찰한 결과, 모든 농도에서 DNA의 분절화가 일어나지 않
았다. AraC에 의한 DNA 분절화 현상은 AraC 첨가 3일 후까지도 전혀 관찰되지 않았다(자료 미제시).
3. Caspase 계통의 mRNA 발현 양상
AraC를 농도별로 처리하여 1일 동안 반응시킨 후, 전체 RNA를 얻어 ICE, CPP32, 및 Nedd2 primer를 가지고 RT-PCR을 수행해본 결과 ICE, CPP32, 및 Nedd2 mRNA는 외부의 자극과는 상관없이 정상적인 PC12 세포와 신경성의 PC12 세포에서 모두 발현되었다(Fig. 4).
4. Caspase-1/caspase-3의 활성도 변화 양상
AraC를 농도별로 처리하여 1일과 2일 동안 반응시킨 후, ICE와 CPP32의 활성도를 측정해본 결과, 정상적인 PC12 세포와 신경성의 PC12 세포 모두 ICE와 CPP32 활성도의 증가가 나타나지 않았다(Fig. 5).
고찰
정상적으로 배양된 PC12 세포와 신경성으로 분화된 PC12 세포에 농도별로 AraC를 처리한 결과는 Fig. 1, 및 Fig. 2에 나타나 있다. 즉, PC12세포에 농도별로 AraC를 1일 동안 처리한 세포는 세포형태 변화와 세포 viability에 큰 변화가 없었으나, AraC를 2일 동안 처리한 세포는 AraC의 농도가 높을수록 세포막이 크게 손상되어 세포형태가 크게 변화되었고, 세포 viability 역시 30%정도로 급격히 감소하였다. PC12 세포를 NGF를 첨가하여 배양시키면, post-mitotic 상태로 전환되면서 신경세포의 형태를 나타냈다. 이 세포에 AraC를 농도별로 처리하여 1일 동안 반응시켜본 결과 세포 형태의 변화는 거의 없었고, 2일 동안 반응시켰을 경우에도 역시 세포 형태에는 큰 변화는 없었다. 이는 Chang과 Brown의 다음과 같은 연구결과(1996)와 일치하고 있다. 즉, neuronal PC12 세포는 AraC를 농도별로 처리하여 1일 동안 반응시켰을 경우 세포 viability는 대조군과 차이를 나타내지 않았으나, 2일부터 세포 viability 변화를 나타냈다. AraC의 농도를 100μM로 처리하여 2일 동안 반응시켰을 경우 세포 viability는 약 60%로 감소하였고, 3일 동안 반응시켰을 경우는 약 50%로 감소하였다. 정상적인 PC12 세포가 신경성 PC12 세포보다 AraC에 더 민감하였다. 이는 곧, AraC의 DNA합성과 수선을 저해하는 속도가 2'-deoxycytidine에 의존하는 기전을 저해하는 속도보다 더 느림을 암시해주는 것으로 생각되어진다.
AarC를 농도별로 처리하여 1일과 2일 동안 반응시켜 DNA 분절화를 관찰한 결과 AraC를 300μM까지 처리하였을 경우 정상적인 PC12 세포에서는 DNA의 분절화가 전혀 일어나지 않았다. 이러한 연구결과는 임은정 등(1997)의 에탄올 연구결과에서도 나타난 현상이다. DNA가 손상을 입고, 세포사망이 일으나는 것을 MTT 분석방법 등으로 확인할 수 있었으나, 실질적으로 DNA 분절화 현상은 확인할 수 없었다. 이는 synovial cell을 대상으로한 세포사망 연구 결과인 뚜렷한 DNA 분절화를 관찰할 수 있었던 것과 대조적이며(Park등 1997), 아마 세포마다 각기 다른 세포사망 경로로 갖고 있기 때문으로 짐작된다.
AraC를 농도별로 처리하여 1일과 2일 동안 반응시킨 신경성의 PC12 세포에서 DNA 분절화를 관찰한 결과, 모든 농도에서 DNA의 분절화가 일어나지 않았다. AraC에 의한 DNA 분절화 현상은 AraC 첨가 3일 후까지도 전혀 관찰되지 않았다. 이 결과만으로는 PC12 세포가 AraC에 의해 세포사망을 유발된다고 볼 수 없었다. 따라서, 정상적인 PC12 세포의 경우는 다른 실험이 더 선행되어야 하고, 신경성의 PC12 세포인 경우는 AraC 반응 시간을 더 연장하여 DNA 분절화를 관찰하여야 AraC에 의해 세포사망이 유도되는지를 더 정확히 알 수 있을 것으로 생각되어진다.
AraC를 농도별로 처리하여 1일 동안 반응시킨 후, 전체 RNA를 얻어 세포사망에 관련된 효소들의 mRNA를 점검한 결과, ICE, CPP32, 및 Nedd2 mRNA는 외부의 자극과는 상관없이 정상적인 PC12 세포와 신경성의 PC12 세포에서 모두 발현되었다(Fig. 4). 이 결과에 의하면, 정상적인 PC12 세포에서 ICE, CPP32 그리고 Nedd2의 활성도는 전사(transcription)단계에서 조절되어지는 것이 아니라 번역후(post-translation)단계에서 조절되어지는 것으로 생각되어진다. 이러한 연구의 결과는 본 연구실에서 수행하였던 에탄올 산화성 스트레스에 의한 세포사망과 이를 저해하기 위하여 Bcl-2를 영구적으로 발현시키는 세포에서의 세포사망 연구의 결과와 일치한다고 볼 수 있다(임은정 등 1997).
AraC를 농도별로 처리하여 1일 동안 반응시킨후, 세포사망에 관련된 효소들의 활성도를 측정해본 결과, 정상적인 PC12 세포와 신경성의 PC12 세포 모두 ICE와 CPP32 활성도의 증가가 나타나지 않았다(Fig. 5). 배양액에서 NGF 제거된 상태에서 정상적인 PC12 세포와 신경성의 PC12 세포 모두에서 ICE의 활성도가 나타났다는 Troy등(1996)의 결과와 비교할 때, PC12 세포는 혈청이나 NGF 제거에 의해서는 ICE와 관련된 세포사망 경로를 거치게 되나, AraC 처리의 경우에는 ICE가 관련된 경로가 아닌 다른 경로를 통해 세포사망이 일어나는 것으로 추정되었다. 이는 Greene 그룹의 신경세포 여러 다양한 세포사망과 그에 따른 세포사망 경로가 모두 다르다는 최근 연구 결과와 일치하고 있다(Park등 1998). 그들에 따르면, 교감신경세포의 세포사망에 이르는 경로가 DNA 손상을 일으키는 물질들, NGF의 고갈, 및 superoxide dismutasee(SOD)의 고갈에 따른 경로 등이 다르다고 한다. NGF 고갈이나 DNA 손상 물질인 camptothecin에 의해 유도된 신경세포의 세포사망에는 세포환 관련 신호전달이 중요한 역할을 수행하는 것으로 보인다.
특히, cyclin 의존성 단백질 인산화효소(CDK) 저해제인 flavopiridol과 olomoucine은 AraC나 UV 처리에 의해 유도되는 세포사망을 방어하는 것으로 밝혀졌다. Camptothecin, AraC, 및 UV 처리에 의하여 DNA가 손상 받으며, 세포사망을 일으키는 것으로 보이는데 NGF 고갈에 의해 유도되는 세포사망과 같이 세포환에 관련된 요소의 활성화가 필수적인 것으로 추정하였다. Flavopiridol이나 olomoucine은 SOD 결핍에 의한 세포사망에는 효과가 없는 것으로 밝혀졌는데, 이는 CDK가 신경세포의 사망에는 큰 역할을 수행하지 않을 가능성을 제시하였다. NGF 고갈, SOD 결핍, 및 DNA 손상 물질의 처리에 따른 세포사망의 경로를 규명하기 위한 연구에서 cystein aspartase(caspase family)의 저해제에 반응하는 상태를 확인하였는데, 이들 방법으로 유도된 세포사망의 경우에는 caspase의 저해제인 V-ICEinh와 BAF가 효과적이었다.
이에 반하여 caspase 저해제의 일종인 zVAD-fmk은 NGF 고갈이나 SOD1 결핍에 의한 세포사망은 저해하였으나, DNA 손상 물질에 의해 유도된 세포사망의 경우에는 방어효과가 없었다. 결국, 신경세포의 세포사망을 일으키는 경로도 여러 가지가 있으며, 같은 신경세포에서도 세포사망 세부 경로나 caspase 및 caspase 저해제의 작용기전도 다르다는 것을 의미한다. 이는, PC12 세포에서 AraC의 첨가에 따른 세포사망의 경로도 단순하지 않음을 의미하며, 신경세포의 세포사망에 따른 퇴행성 신경질환이나 신경정신과질환의 치료 가능성을 타진하기 위해서는 이들의 기전의 이해가 필수적임을 암시하고 있다.
결론
MTT 분석으로 세포의 viability 측정 결과 mitotic 성질을 갖는 정상적인 PC12 세포와 postmitotic 성질을 갖는 신경성의 PC12 세포 모두 AraC에 의해 세포사망이 유도됨을 관찰하였다. RT-PCR방법을 사용하여 AraC에 의한 PC12 세포사망 기전에 caspase-1/caspase-3(ICE/ CPP32)가 관련되어 있는지를 확인하고자 하였으나, caspase-1/caspase-3 mRNA 모두 외부 자극과는 상관없이 계속 발현됨으로써 mRNA수준에서는 그 관련성 여부를 확인할 수가 없었다. Caspase-1/caspase-3의 활성도 측정에서도, AraC를 처리한 정상적인 PC12 세포와 신경성의 PC12 세포 모두에서 활성을 나타내지 않았다. 성장인자가 제거된 정상적인 PC12 세포와 NGF가 제거된 신경성의 PC12 세포 모두에서 caspase-1(ICE)의 활성도가 나타냈다는 Troy등(1996)의 결과와 비교할 때, PC12 세포는 성장인자 NGF 제거에 의해서는 caspase-1과 관련된 세포사망 경로를 거치게 되나, AraC 처리의 경우에는 ICE가 관련된 경로가 아닌 다른 경로를 통해 세포사망이 유도되는 것으로 추정된다.