Korean Journal of Biological Psychiatry

교신저자：조연규, 133-792 서울 성동구 행당동 17 
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서     론

   정신의학이 전통적인 의학모델의 하나로 확고히 자리잡은 지 200년 이상이 되었으나 아직도 각종 정신질환의 원인을 정확히 알아낸 바가 없으며, 여러 가지 원인론적 가설들이 검증되지 못한 상태로 남아 있다. 따라서 정신질환에 접근하는 새롭고 획기적인 연구방법이 필요하게 되었고, 최근 각광을 받고 있는 분자생물학적 방법이 도입되면서 정신질환의 연구는 새로운 전기를 맞이하게 되었다. 그 동안 신경전달물질, 신경조절물질, 신경전달물질 수용체, 신경내분비계 등에 대한 신경생화학적 연구가 진행되고 있었으며, 생화학적 방법을 이용한 근래의 연구들은 연접간격(synaptic cleft)의 신경전달물질의 변화나 신경세포막 수용체의 변화에 관한 것들이었으나, 분자생물학적 방법이 도입되면서 세포막에 전달된 신호가 세포 내에서 어떠한 변화를 일으켜 세포의 형질변화에 이르게 되는지에 관심을 갖게 되었다. 바다달팽이(Aplysia)의 long-term facilitation에 유전자발현이 필요하다는 것이 밝혀진(Montarolo 등 1986) 이후로 신경활동이 유전자수준의 변화를 포함하고 있다고 인식하게 되었고, 정신질환을 치료하는 약물들의 효과가 투여 후 일정시간이 지나야 나타나는 점등은 이 질환의 발병과 치료에도 유전자 수준의 변화가 관여할 것이라는 예측을 가능케 하였다(Meltzer 1987). 그래서 정신질환도 유전자 발현에 직접 또는 간접적으로 영향을 미치는 화합물에 의해 발생되기도 하고 치료될 수도 있으리라고 기대하고 있다(Esterle와 Sanders-Bush 1991).
   외부의 물리화학적 또는 스트레스나 약물에 의한 자극에 대해 즉시 반응하여 처음으로 나타나는 유전자활동은 immediate-early gene들(이하 IEGs) 이다(Chavrier 등 1988；Cochran 등 1983；Lau와 Nathan 1987；Suckhatime 등 1987). 성장인자에 의한 세포의 분열이나 분화에 관여하는 인자(Greenberg 등 1985；Muller 등 1984)로 생각되던 proto-oncogene인 IEGs가 신경세포와 같이 이미 분화된 세포에서도 발현된다는 사실이 알려진 후, 이들이 신경세포의 신호전달체계에 관여하리라는 가설이 제기되었다(Morgan과 Curran 1989).
   IEGs를 발현시키는 외부자극들로는 신경세포에 영향을 미치는 물리, 화학적 자극들인 뇌허혈(Jorgensen등 1989), 뇌손상(Dragunow와 Robertson 1988), NMDA(N-methyl-D-aspartate)를 비롯한 글루탐산염(glutamate) 수용체의 자극(Szekely 등 1987), amphetamine과 cocain(Graybiel 등 1990), 화학적 경련제(Dragunow와 Robertson 1987；Morgan 등 1987；Sagar 등 1988；White와 Gall 1987), 전기경련충격(권택술 1993；양병환 등 1996；유정희 1991；정희연 1996；채인영 1992：Cole 등 1990；Daval 등 1989) 그리고 항정신병약물(김광수 등 1996；안용민 등 1994；이민수 등 1996)이 있다. 이 IEGs는 세포 표면에 전달된 여러 가지 자극들이 특정 유전자의 발현을 조절하여 장기적인 세포반응을 일으키는데 관여한다고 알려졌다(Curran 1988；Kaczmarek과 Kaminska 1989).
   이러한 IEGs 중에서 가장 잘 알려진 것이 c-fos 이다. c-fos는 FBJ(Finkel-Biskis-Jinkins)와 FBR(Finkel-Biskis-Reilly) murine osteogenic sarcoma virus의 암유전자인 v-fos의 정상세포동종으로(Muller 등 1984；Ruther 등 1985) 55,000 Dalton의 인산단백(phosphoprotein)으로 구성된 proto-oncogene이다(Curran과 Morgan 1987). 그리고 c-fos는 promoter부위에 SRE(serum responsive element), CaRE/CRE(calcium responsive element/cAMP responsive element), SCMRE(sis-conditioned medium-responsive element)를 갖고 있다. FOS(c-fos protein)는 JUN(c-jun protein)과 이종접합체를 형성하여 전사인자로서 표적유전자의 AP-1 site에 결합하여 활성을 조절한다(Curran 1988). c-fos는 중추신경계에서 다양한 생리작용 및 약물에 의해 발현될 수 있는 전사인자(transcriptional factor)로 신경세포의 활성을 측정하는 지표로 평가되어 신경정신과영역에서도 약물이나 스트레스가 중추신경계에 미치는 영향을 조사하는 데 쓰이고 있다(Dragunow 등 1990；Morgan과 Curran 1991；Robertson과 Fibiger 1992).
   신경정신과 영역의 연구들은 치료효과가 뚜렷한 전기경련충격요법과 항정신병약물들에 집중되고 있다. 이는 전기경련충격과 약물들의 작용기전을 이해하고 생체 내에서 그 작용부위를 밝혀보려는 시도라고 할 수 있다(유정희 1991；채인영 1992；Cole 등 1990；Daval 등 1989；Hunt 등 1987；Minami 등 1990；Morgan 등 1987；Sagar 등 1988；Sharp 등 1989；Zawia와 Bondy 1990).
   최근의 정신과 약물에 대한 연구는 주로 항정신병약물들에 관한 것이었다(Miller, 1990；Dragunow 등 1990；Nguyen 등 1992；Robertson과 Fibiger 1992；Morgan과 Curran 1986；안용민 등 1994). 
   항우울제를 이용한 연구들도 비교적 최근에 활발히 이루어지고 있다(Beck 1995；Beck과 Fibiger 1995；Tilakaratne 등 1995). 그러나 아직은 항우울제와 c-fos관련 연구들이 항정신병약물이나 전기경련충격처럼 다양하고 많지는 않다.
   상기 연구들을 종합해보면 전기경련충격과 항우울제의 경우에 대부분 해마에서 c-fos 발현에 변화가 있었으나 항정신병약물의 경우에는 그렇지 않았다. 또한 위의 연구들은 대부분 Northern blot analysis나 면역세포화학(imunocytochemistry)을 이용하여 정성적인 분석에 치우친 반면 정량적인 면에는 약점을 갖고 있다고 하겠다. 다시 말해서 미세한 mRNA발현의 변화는 관찰하지 못했을 가능성이 있다.
   본 연구는 우울증에서 중요한 병리적 소견이 있다고 추정되는 해마를 연구부위로 하였다. 정량적 방법으로는 경쟁적 역전사효소-중합효소연쇄반응기법을 이용하였다.

   또한 그 동안의 생체나 세포주를 대상으로 한 실험들과는 달리 이 연구에서는 일차 배양한 흰쥐의 해마신경세포를 대상으로 하였다. 물론 약물에 의해 일어나는 인체의 변화를 단일세포에서 알아본다는 것이 한계가 있지만, 이는 여러 가지 환경 변수에 관한 통제가 제대로 이루어지지 않는 생체실험보다 우선되어야 하는 기초연구라고 생각한다. 또한 배양한 해마신경세포와 정신과 약물들을 이용하여 IEGs 발현을 조사한 연구로는 국내에서 이 연구가 최초이다. 이 연구에서는 항우울제의 대표격인 imipramine과 amitriptyline을 이용하였다. 이 연구는 약물에 의한 IEGs의 발현을 관찰한 연구이며, 부수적으로 기억기능과 IEGs의 관계를 밝힐 수 있는 기초자료를 얻기 위한 연구이다. 왜냐하면 해마는 기억의 중요기능을 담당하는 것으로 알려져 있고(이정균 1981), 이 연구에 쓰인 약물들의 부작용중 하나로 기억력장애가 일어난다는 것이 널리 알려져 있기 때문이다(Amado-Boccara와 Danion 1994；Branconnier 등 1982；Danion 1993；Lamping 등 1984；Perlick 등 1986；Stip 1996).

연구방법

1. 실험동물 및 사용 시약
   1) 실험동물은 대한 동물실험 센타에서 구입한 Sprague-Dawley 종을 사용하였고, 교배는 한양대학교 생화학과 실험동물 사육장에서 실시하였다.
   2) 사용시약 중 RNAzol TM은 Biotecx Laboratories사(Texas, U.S.A.), dNTP, RNAsin, AMLV reverse transcriptase 등은 Promega사(Wisconsin, U.S.A.)의 제품을 이용하였으며, Taq DNA polymerase는 Korea Biotech이나 Perkin-Elmer사에서 구입하였다.

2. 실험방법

1) 흰쥐 태아의 해마신경세포 배양
   임신 18일(E18)된 흰쥐를 ether를 사용하여 희생시킨 후, 무균 조작 하에서 태아를 분리했다. 분리한 태아에서 해마를 절제하여 Mytilineou와 Friedman(1988)의 방법을 변형하여 신경 세포배양을 시행하였다. 뇌막을 완전히 제거한 뇌조직을 파스퇴르 파이펫을 사용하여 단리세포를 얻은 후, 700rpm에서 8분간 원심분리하고 침전된 세포는 배양액으로 다시 부유시켰다. 동일 조작을 2회 반복한 후, 10% 우태아 혈청이 들어간 DMEM 배양액으로 부유하여 광학현미경하에서 세포 수를 측정하고, 6 well plate에 각각 1-2×10 6세포들을 배양하였다(그림 1). 
   순수 신경세포 배양을 위해 혈청이 함유되지 않은 defined media를 사용하였다. 배양 시작 18~20시간 후 우태아 혈청대신 10μg/ml insulin, 20μg/ml transferrin, 30mM selenium, 20nM progesterone, 0.1mM putrescin, 1mM pyruvate, 2mM L-glutamine, 50U/ml penicillin, 50μg/ml streptomycin, 30mM glucose가 첨가된 DMEM 배양액으로 교환하고, 37°C, 5% CO2 배양기(incubator)에서 배양하였다. 배양용기는 poly-L-lysine으로 외막처리(coating)하고 증류수로 3번 세척한 후 수분을 없애 사용하였다.

2) 약물처리 및 RNA 추출 
   4일간 배양한 총 15개의 plate에 amitriptyline과 imipramine을 증류수에 녹여 각각 0μM, 1μM, 10μM, 100μM,및 1mM의 농도로 만든 후 배양액에 섞어 처리하였다. 이후 30분간 배양하여 total RNA를 분리하였다. RNA를 분리하기 전 PBS(phosphate buffer saline)로 신경세포를 3번 정도 세척한 후, 6 well plate 각 well당 1ml RNAzol TM을 넣고 파이펫을 사용하여 RNA를 녹였다. 이것을 미세 원침튜브(micro-centrifuge tube)에 각각 넣고, chloroform 0.1ml을 넣어 15초 동안 진탕(vortaxing)한 다음 얼음에 5분간 넣어 두었다. 12,000g, 4°C, 15분에서 원심분리하고 물층을 분리하여 새 미세원침튜브(micro-centrifuge tube)에 넣었다. 여기에다 동량의 isopropanol을 넣고, 얼음에 30분간 놓아 둔 다음, 12,000g, 4°C에서 15분에서 원심분리 하였다. 상층액을 제거하고 RNA 압착결정(pellet)을 75% 에탄올로 세척하였다. 이것을 DEPC(diethyl-pyrocarbonate：RNA분해효소억제제) 처리된 물에 녹인 다음 분광광도계(spectrophotometer)로 정제한 RNA를 정량하였다.

3) c-fos mRNA 정량
   소량의 검체에서 특정 mRNA를 정량하기 위해 경쟁적 역전사효소-중합효소연쇄반응법(competitive RT-PCR, 이하 CRT-PCR)을 사용하였다(양병환 등 1996). 정량을 할 검체 RNA에, 같은 Primer 염기 서열을 갖고 있고 중합효소연쇄반응(PCR)의 산물 크기를 다르게 하기 위해 결손(deletion)된 RNA(RNA-CRS)를 일정량 넣어 주어 역전사효소-중합효소연쇄반응법(RT-PCR)을 시행하였다.
   정량을 해야할 검체의 특정 mRNA가 일정량 넣어 준 RNA-CRS와 그 양이 같다면, 밝기가 비슷한 2개의 띠(band)가 한천겔(agarose gel)상에 나타나게 될 것이다. 만약 검체의 특정 mRNA가 많다면 위 띠 하나만 나타날 것이고, 일정량 넣어준 RNA-CRS가 많다면 아래 띠 하나만 나타나게 될 것이다. RNA-CRS 일정량을 1/2씩 희석시켜 각각의 검체 RNA와 RT-PCR을 하게 되면 2개의 띠의 밝기 비교로 검체의 특정 mRNA를 정량할 수 있다.

(1) c-fos primer sequences
   Primer의 염기서열은 미국국립보건원 산하 NCBI의 유전자은행(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)을 이용하여 흰쥐의 c-fos 유전자 염기서열을 얻었으며, Primer set의 고안은 Primer Detective Program(Clontech ver. 1.01)을 사용하였다. 그리고 이 Primer들의 합성은 SCL의 Gene Research Center에 의뢰하였다.
   Primer 1：5’-TCTGC TGCAT AGAAG GAACC AGTCA TCAAA GGGTT CAGCC-3’
   Primer 2：5’-AATTT AATAC GACTC ACTAT AGGGA CTTGA AGACG AGAAG TCTGC-3’
   Primer 3：5’-TCTGC TGCAT AGAAG GAACC-3’
   Primer 4：5’-CTTGA AGACG AGAAG TCTGC-3’
   위의 각각의 Primer들을 그림 2에 그림으로 나타내었다.
   Primer 1(3’→5’)은 40mer로 구성되어 있으며, 처음 5’부분의 20mer와 3’부분의 20mer 사이에는 91bp의 유전자가 결손되어 합성되게 고안하였다. Primer 2(5’→3’)는 45mer이고 처음 5’부분의 25mer는 mRNA에 상보적이나 3’부분의 20mer는 T7 RNA polymerase가 결합할 수 있는 부분을 가지고 있다. 그리고 Primer 3와 Primer 4는 upstream과 downstream사이의 nested primer가 되게 하였다. 

(2) RNA-CRS 제조
   흰쥐의 뇌로부터 total RNA를 분리하여, 0.5μM Primer 1, 1×RT buffer, 1mM dNTP, 39U RNase inhibitor, 200U MMLV RT(reverse transcriptase)가 들어있는 총 부피 20μl인 RT 반응물에 2.5μg RNA를 넣어 반응시켰다. 반응을 42°C에서 1시간동안 하고, 75°C에 10분간 처리하여 반응을 종결시켰다.
   합성된 cDNA는 1×PCR buffer, 1mM dNTP, 1μM Primer 1, 1μM Primer 2, 5U Taq DNA polymerase가 들어있는 총 부피 100μl PCR 반응물에서, 94°C에서 1분, 55°C에서 1분, 72°C에서 1분씩 35cycles로 DNA를 증폭시켰다. 증폭시킨 DNA를 2% 한천겔 상에서 확인하고, 겔로부터 정제하였다.
   정제한 DNA를 분광광도계(spectrophotometer)로 정량하여, DNA 1μg을 1mM rNTP, 1×buffer, 10mM DTT, 20U T7 RNA polymerase, 20U RNAsin이 들어있는 총 부피 20μl 반응물에서 37°C, 60분간 반응시키고 나서, DNase I으로 37°C, 15분간 반응시켜 template로 사용했던 DNA를 효소로 제거하였다. 순수 RNA-CRS를 얻기 위해 RNAzol^TM을 가지고 정제하고, RNA-CRS를 분광광도계로 정량하였다. DNA 오염여부 검증을 위한 대조군은 RNA-CRS를 가지고 역전사효소(RT)를 뺀 시료를 RT-PCR하였다.

(3) 경쟁적 역전사효소-중합효소연쇄반응(competitive RT-PCR)
   Reidy 등(1995)의 방법을 변형하여 cDNA합성과 RT-PCR을 동시에 수행하였다. 즉, 5개의 tube 각각에 1/2씩 희석시킨 RNA-CRS를 넣었다. 16.5U RNase inhibitor, 1mM dNTP, 1.3μM Primer 3, 1.3μM Primer 4, 1×Taq buffer, 5U AMV-RT, 1.25U Taq DNA polymerase, 1μg sample total RNA를 섞어 master mix를 만든 다음, 위의 tube 각각에 일정량씩 넣었다. 65°C에서 10분, 50°C에서 8분, 95°C에서 5분에서 반응하여 cDNA를 합성하고, 94°C에서 1분, 55°C에서 1분, 72°C에서 1분에서 34 cycles, 94°C에서 1분, 55°C에서 1분, 72°C에서 4분에서 1 cycle로 DNA를 증폭하였다. PCR 반응이 다 끝나고 나서, 2% 한천겔에서 확인하고 사진을 찍었다. 찍은 사진을 scanner를 사용하여 흑과 백을 바꾸고 각 띠의 밝기를 밀도계(densitometer)로 읽었다. 두 띠의 RNA 크기가 다르기 때문에 밀도계로 측정한 값을 보정해 주어야 하는데, Menzo 등(1992)의 방법으로 다음과 같이 환산하였다.
   RNA-CRS의 밀도(D)×c-fos bp/RNA-CRS bp=D×(437bp/346bp)=D×1.263
   이같이 보정해 준 값으로, Y축에는 표본 total RNA에 대한 RNA-CRS band 밝기 비율 값을, X축에는 RNA-CRS moles가 있는 그래프를 그렸다. 그래프에서 Y값이 1인 X값을 표본의 total RNA에 들어있는 c-fos양으로 결정하였다. 

결     과

   일차배양한 흰쥐의 해마신경세포에 imipramine과 amitriptyline을 처치하였을 때 일어나는 c-fos mRNA발현의 변화를 경쟁적 역전사효소-중합효소연쇄반응법으로 정량해 보았다.
   결과들을 수식으로 표기하기 위해 image analysis를 이용하여 각 띠(band)의 밀도를 결정하였고, 이를 그래프로 나타내었다. X-축은 RNA-CRS의 농도(mol)이고, Y-축은 c-fos 띠의 밀도를 RNA-CRS 띠의 밀도로 나눈 값이다. 이렇게 만들어진 표준곡선의 Y-축이 1이 되는 지점의 X값이 발현된 c-fos mRNA의 농도이다. 검체 RNA 1μg당 c-fos mRNA의 양을 attomol(10^-18)단위로 나타내었다(표 1).

1. Imipramine
   대조군(0μM)의 c-fos mRNA 농도는 3.46amol/μg이고 1μM에서는 2.36amol/μg, 10μM에서는 8.11amol/μg으로 증가하였다. 그리고 100μM과 1mM에서는 c-fos mRNA의 발현을 관찰할 수 없었다(그림 3-10).

2. Amitriptyline 
대조군(0μM)의 c-fos mRNA농도는 4.46amol/μg이고 1μM에서는 5.62amol/μg, 10μM에서는 5.47amol/μg으로 나타났다. 그리고 100μM이상에서는 c-fos mRNA의 발현을 관찰할 수 없었다(그림 11-19).

고     찰

   이 연구는 일차배양한 흰쥐의 해마신경세포에서 항우울제의 분자생물학적 기전을 알아보기 위해서 실시하였다. 최근 정신의학의 생물학적 연구에 분자생물학적 방법이 도입되면서, 동물을 이용한 생체실험뿐 아니라 기초적인 연구를 위해 일차 배양한 세포도 실험에 이용하고 있다. Szekely 등(1987；1989；1990)은 소뇌 신경세포에서 NMDA수용체를 통하여 글루탄산염에 의해 유도된 c-fos를 관찰하였고, 이들은 비슷한 결과를 해마신경세포에서도 얻어내었다. 성상세포(astrocyte)에서는 신경세포와 달리 NMDA수용체에 의해 c-fos가 발현되지 않는다는 보고도 있었다(Condorelli 등 1989；McNaughton과 Hunt 1992). 해마의 추체세포(pyra-midal cell)를 일차배양하여 tyrosine kinase 수용체의 존재를 보고한 연구(Marsh 등 1993)도 있었다. 이와 같이 외국에서는 일차배양한 세포를 대상으로 연구들이 활발하게 이루어지고 있는데 비하여 국내에서는 이에 관해 보고된 연구가 거의 없다. 따라서 저자는 일차배양한 해마 신경세포를 이용하여 정량적인 방법으로 c-fos의 발현을 관찰하는 연구를 국내에서는 처음으로 시도하였다.
   이 연구의 결과들을 종합하여 보면 다음과 같다. Imipramine과 amitriptyline 공히 c-fos mRNA의 양이 1μM과 10μM에서 대조군에 비해 차이가 없었다. 그리고 약물의 농도를 높여서(100μM 이상) 처리한 경우에는 두 약물 모두에서 c-fos mRNA의 발현을 관찰할 수 없었다. 이 연구의 결과에서 나타난 c-fos mRNA양의 수치상의 차이는 측정단위가 attomol로 매우 작기 때문에 의미가 없다.
   Imipramine과 amitriptyline은 세로토닌과 노르에피네프린의 흡수차단제(up-take blocker)로서 시납스전(presynapse)에서 이 신경전달물질들의 재흡수(reuptake)를 막아 결과적으로 농도를 증가시킨다고 알려진 약물이며, 이러한 효과는 약물투여 초기에 일어나는 현상들이다(Silver와 Yudofsky 1988). 삼환계 항우울제에 대한 분자생물학적 연구들은 주로 이 약물들이 일정기간이 지나야 효과를 나타내는데(Goodman과 Charney 1985) 착안하여, 장기간 약물투여 후에 일어나는 변화를 관찰한 것들이 많았다. Beck와 Fibiger(1995)는 흰쥐에서 스트레스로 유발된 Fos-양성 신경세포들의 수가 10일간의 desipramine투여 후 복측대상회피질(anterior cingulate cortex), 복측대상핵(anterior claustrum), 편도중앙핵(central nucleus of the amygdala), 배측해마의 치상회(dentate gyrus of the dorsal hippocampus) 그리고 시상실방핵(paraventricular nucleus of the thalamus)에서 유의하게 감소됨을 관찰하였다. Tilakaratne 등(1995)은 desmethylimipramine을 21일간 투여한 후 흰쥐의 해마와 전두엽피질에서 5-HT2 효현제인 2,5-dimethoxy-4-iodo-amphetamine에 의해 탈감작(desensi-tization)을 나타낸다고 보고하였다. Nibuya 등(1996)은 imipramine과 몇 가지 항우울제를 흰쥐에게 장기 투여하여 해마에서 CREB(cAMP response element binding protein)의 mRNA의 발현이 증가하는 사실을 보고하였다. 이들은 모두 항우울제의 장기투여 후에 일어나는 해마부위의 변화를 관찰하였다. 저자의 연구결과에서 삼환계 항우울제의 단기적이고 직접적인 자극으로는 해마신경세포에서 c-fos 발현의 변화가 일어나지 않은 것은, 뇌의 다른 부위에서 일어나는 초기 변화가 해마에는 일련의 과정을 거쳐 일정한 시간이 경과한 후에 영향을 미친다고 해석할 수도 있다.
   근래 정신과 약물들의 초기투여와 장기투여후의 효과를 구분해서 바라보는 시각이 생겼는데(Heninger와 Charney 1987；Menkes 등 1980；Spyraki와 Fibiger 1980；Sulser 등 1978), 이를 발전시켜 개시(initiation)와 적응(adaptation)이란 개념(Hyman과 Nestler 1996)으로 작용기전을 이해하려고 하고있다. 즉 적절한 용량과 적절한 투여 회수가 개시를 그리고 적절한 기간동안 투여가 계속될 때 적응이 일어난다는 가설이다. 또한 장기간의 약물투여에 의해 일어나는 효과는 또한 LTP(long-term potentiation)(Bliss와 Lomo 1973)의 개념으로도 이해할 수 있기 때문에 Krox-24와 같이 LTP현상에서 꾸준히 관찰되는 IEG(Cole 등 1989；Wisden 등 1990)를 대상으로 한 연구도 필요하다고 생각된다. 따라서 해마신경세포에서 일어나는 초기변화에 관여하는 IEG는 c-fos가 아닐 가능성이 있는 것이다. 차후에 항우울제가 해마신경세포에 미치는 영향을 관찰하려면 Krox-24를 비롯한 다른 IEGs들을 대상으로 한 연구도 이어져야 하겠다. 그리고 항우울제의 장기투여가 해마신경세포의 c-fos발현에 미치는 영향을 관찰하려면 세포배양의 어려움은 있으나 항우울제의 지속적인 처치 후에 시간변화에 따른 c-fos발현의 변화를 조사해볼 필요가 있겠다.
   이 연구에서 고농도(100μM 이상)의 약물처치 시에는 c-fos mRNA가 전혀 발현되지 않았다. 다른 IEGs에도 같은 결과가 나올지를 예측할 수 없지만 이 실험의 결과만을 놓고 본다면 두 가지 가능성을 가정할 수 있다. 그 하나는 imipramine 그리고 amitriptyline이 고농도에서는 해마신경세포에서 c-fos의 발현을 억제시킨다고 볼 수 있다는 것이다. 이는 해마의 어떠한 기능의 억제와 연관시켜 볼 수 있는데, 저자는 기억기능과의 관련을 가정해 보았다. 신경계의 유전자 발현에 변화가 오면 학습이나 기억 등 획득된 정보를 보관하는데 관련된 뇌기능에 장기적 혹은 영구적인 변화를 초래할 수 있다고 본다(Dragunow와 Robertson 1987；Goelet 등 1986). 따라서 c-fos의 발현이 억제된 것이 부작용 중 하나인 기억력장애와 분명히 관련지을 수 있다고는 말할 수 없으나 추후의 연구를 통해서 확인해 볼 필요가 있다고 본다. 또 하나의 가능성은 고농도에서 세포가 기능을 정지하고 세포사를 초래했을 가능성이다. 이렇게 되면 역시 해마신경세포의 기억기능에 장애가 올 수 있을 것이다. 이 연구에서는 해마신경세포의 세포사를 확인하지 못했으나 추후에 계속되는 실험에서 MTT colorimetric assay와 같은 방법으로 확인할 수 있을 것이다(Mosmann 1983). 
   이상과 같이 저자는 일차배양한 흰쥐의 해마신경세포를 대상으로 imipramine과 amitriptyline이 c-fos mRNA의 발현에 미치는 영향을 관찰하고 분석하여 이들 약물들의 분자생물학적 작용기전을 알아보는 시도를 하였다. 이 연구는 단일세포를 대상으로 하였기 때문에 복잡하고 상호 유기적인 연결통로를 갖고있는 두뇌의 작용에 적용시키는 데는 한계가 있다. 또한 흰쥐의 교배와 세포배양의 어려움으로 인해 시간별 c-fos mRNA의 발현변화를 관찰하지 못하고, 고농도의 약물처리시에 c-fos mRNA가 발현되지 못한 원인을 자세히 밝혀내지 못했다. 또한 c-fos 이외의 IEGs들에 대해서도 동시에 조사를 하지 않았기 때문에 해마의 기억에 관련하는 기능과 IEGs발현과의 관계를 유추하는 데도 한계가 있다. 그러나 이 연구는 생체실험에서 보이는 스트레스나 동통에 의한 비특이적인 IEGs의 발현(Nakajima 등 1989；Sharp 등 1991)으로 결과가 오염되거나 뇌의 다른 부위의 활동에 따른 이차적인 영향을 받아 결과가 왜곡되는 것을 배제할 수 있어, 순수한 해마신경세포의 약물에 대한 반응을 관찰할 수 있었다. 그리고 정량적인 연구를 할 수 있도록 Northern blot analysis를 보완한 경쟁적 역전사효소-중합효소연쇄반응을 이용하였다는데 의의를 둘 수 있다. 향후에 이 연구의 제한점을 보완한 연구로 c-fos이외의 다른 IEGs를 대상으로 관찰하여야 하겠고, 시간 변화에 따른 IEGs의 장기적인 발현양상의 변화도 조사해 보아야 할 과제이다. 

결     론

   이 연구는 대표적인 삼환계 항우울제로 널리 쓰이는 imipramine과 amitriptyline의 흰쥐의 해마에서의 작용기전을 분자생물학적 수준에서 이해하기 위해 실시되었다. 임신 18일된 Sprague-Dawley 흰쥐의 태아에서 해마신경세포를 추출하여 일차배양하였고, 세포배양 4일째 되는 날 모두 15개의 배양용기의 배양액에, imipramine과 amitriptyline을 각각 0M, 1μM, 10μM, 100μM,및 1mM의 농도로 만들어 혼합하여 30분간 배양한 후에 RNA를 추출하였다. 이 약물들이 c-fos발현에 미치는 영향을 정량적으로 알아보기 위해 경쟁적 역전사효소-중합효소연쇄반응법을 이용하였다.
   두 약물 공히 10μM이하에서 c-fos mRNA의 발현이 대조군에서의 발현량과 차이가 없었고, 100μM이상에서는 c-fos가 발현되지 않았다. 이 약물들은 저농도에서는 해마신경세포에서 c-fos의 발현증가를 일으키지 않으며, 고농도에서는 발현을 억제시키거나 세포기능을 방해하는 것으로 나타났다. 따라서 이 약물들이 해마에 작용하는 기전은 다른 IEGs를 통해서 또는 뇌의 다른 부위에서 전해오는 이차적인 자극일 가능성이 있다. 또한 고농도에서는 해마의 기억기능이 방해받을 수 있다는 것을 추측하게 한다. 해마는 인지, 정동, 기억에 관련하는 부위이며, 그 기능을 알아보는 연구의 기초단계로서 이 연구에 또다른 의미를 둘 수 있다. 향후 해마신경세포에서 다양한 약물이나 물리화학적 자극을 통한 IEGs의 발현양상 관찰하는 연구가 계속되어야 하겠고, 시간변화에 따른 발현양상의 변화도 연구대상에 포함되어야 하겠다.