Korean Journal of Biological Psychiatry

교신저자：이미경, 133-792 서울 성동구 행당동 17번지
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서     론

   알코올 의존은 생물학적인 요인, 심리적, 사회적 요인 등이 복합적으로 작용을 하여 발생하며, 다양한 임상적 특징을 나타내는 병으로 알려져 있다(Cloninger 1991). 알코올의존의 생물학적인 원인은 쌍생아 연구, 양자연구, 위험요인 연구, 가족연구 등을 통하여 조사되어 왔고, 최근 분자 유전학의 발달로 각 질병에 대한 후보 유전자와 유전적 표지자에 대해 연구가 진행되고 있다. 알코올의존의 분자 유전학적 연구는 알코올 대사에 관여하는 효소계와 중추신경계 신경전달 물질의 수용체(receptor), 수송체(transporter) 유전자에 대해 집중적으로 진행되고 있다. 
   알코올 대사에 직접 관여하는 alcohol dehydrogenase(ADH) 및 aldehyde dehydrogenase(ALDH)의 효소의 유전적 변이, 특히 ALDH2*2/2*가 알코올의존에 걸릴 확률이 적다고 하는 보고는 이미 많은 연구에서 반복적으로 결과가 나왔고, ALDH2 유전형이 알코올의존의 생물학적 표지자(biological marker)로 인정받고 있다(김신태 등 1999；Agarwal 등 1987；Crabb 등 1993；Goedde 등 1987；Sherman 등 1995). 
   알코올의존과 최근 유전적 연구의 주요 대상은 신경전달물질들의 수용체 및 수송체, 신경전달물질, 주로 도파민과 세로토닌의 합성 및 대사에 관여하는 효소들을 부호결정(coding)하는 유전자에 대하여 연구가 되고 있다. 도파민이 대상이 되는 이유는 보상체계(rewarding system)의 회로(circuit)인 배측 피개 영역(ventral tegmental area)에서 측좌핵(nucleus accumbens)으로 가는 경로에서 핵심적인 역할을 한다고 알려져 있기 때문이다. Cloninger(1987)는 도파민이 알코올 추구 행동 등 식욕과 관련된 행동에 중요한 역할을 하는 것으로 보고하였다. 소량의 알코올은 도파민 뉴론에 흥분 효과를 초래하여 다행감(euphorigenic effect)을 추구하는 행동을 촉진하는 약물학적인 보상효과(reward effect)를 나타내게 되며, 도파민과 세로토닌 계통의 신경전달체계는, 알코올 추구행동으로 인해서 섭취하게 되는 알코올 복용량을 조절한다고 보고하였다. 
   알코올의존과 도파민과의 연관성에 관해서는 도파민 수용체와 수송체에 관한 연구가 주를 이루고 있다. 도파민에 관한 연구가 수용체와 수송체에 관하여 많이 이뤄지고 있는 이유는 이 부분이 약물이 작용하는 부위가 될 수 있고 특히 도파민 수송체는 시냅스 cleft내의 도파민 농도 유지에 중요한 역할을 하기 때문이다. 
   도파민 D₂ 수용체의 유전적 다형성과 알코올의존에 관해서는 많은 연구가 이뤄져 있고, 그 외에 D₁, D₄와의 연관에 관련 연구도 이뤄져있다. 
   도파민 D₂ 수용체 유전자의 A1의 대립 유전자 빈도가 알코올의존과 강한 연관이 있다는 중복된 연구결과가 나왔고, 이에 대하여 반박하는 연구에서도 중증 알코올의존 장애의 병인에서 A1대립유전자가 조절 유전자 역할을 한다고 보고 되어지고 있다(이종섭 등 1997；Noble 등 1991；Parsian 등 1991).
   도파민 수송체는 도파민의 전시냅스에서 도파민의 재흡수와 시냅스의 신경전달 기능을 하는 도파민 활성을 종결시키는 작용을 하기 때문에 약물 작용의 대상이 되고(Ritz 등 1987), 정신활성 물질과 정신독성 물질의 목표가 된다. 코카인(cocaine)은 도파민 수송체에 결합하여 도파민의 재흡수를 방해하고, 암페타민(amphetamine)은 도파민 수송체를 통해 뉴론에 우선적으로 들어가서 세포외 공간으로 도파민을 역수송(reverse transport) 한다(Jones 등 1998). 신경독성인 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine)는 도파민 수송체에 선택적으로 작용하여 파킨슨씨 효과가 나타게 한다(Gainetdinov 등 1997). 
   도파민 수송체는 구조상 막 통과 단백질(tansmembrane protein)이고, 12개의 막 통과 도메인을 가지고 있고, sodium과 chloride 의존성 신경전달물질 수송체 계열에 속해 있고, 높은 기질 특이성과 친화도를 가지고 있고 노에피네프린 수송체와 66%의 유사성을 가지고 있다.
   알코올의존에서 도파민 수송체의 역할을 조사한 방법은 크게 뇌영상을 이용한 방법과 유전자 분석을 이용한 방법이 있다. 뇌영상을 이용한 연구의 예로서 Tiihonen 등(1995)은 선체(striata)의 도파민 수송체 밀도(dopamine transporter densities)를 비폭력군, 폭력군 알코올의존으로 나눠서 SPECT를 이용하여 조사한 결과, 비폭력군의 도파민 수송체 밀도가 선체에서 낮게 나타났다. Tupala 등(2000)은 측좌핵과 배측 선조체(꼬리핵, 피각핵)에서 알코올의존 I형(늦은 발병, 사회적 의존, 불안동반)에서 도파민 수송체의 밀도가 낮다고 보고하였다. 그리고, 알코올의존 II형은 도파민 수송체의 밀도가 측좌핵과 배측 선조체에서 높게 보고 되었다. Kuikka 등(1998a)과 Volkow 등(1996)은 알코올의존 I형에서 Tupala 등(2000)과 같은 결과인 도파민 수송체 농도가 선체에서 낮게 나왔으나, 알코올의존 II형일 경우에는 결과가 서로 달랐다. 
   인간 도파민 수송체의 유전학 연구는, 인간 도파민 수송체 cDNA를 클로닝한 뒤부터이다. 인간 도파민 수송체 cDNA를 클로닝한 Vandenbergh 등(1992)에 의하면, 도파민 수송체 유전자(DAT1：SLC6A3)는 5p15.3에 위치하고 있다고 하였다. 이 유전자는 3가지 다형성(polymorphism)이 연구되고 있는데, highly polymorphic intron 8의 TaqI Variable Number of Tandem Repeat(VNTR)(Byerley 등 1993), biallelic TaqI Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP)(“TaqI 492”)(Vandenbergh 등 1992b), 3’비전사부분(untranslated region：UTR)의 40bp VNTR(Sano 등 1993；Vandenbergh 등 1992a)가 그것이다. 그 중 40 bp VNTR in the 3’-UTR이 가장 활발하게 연구되고 있다. 이 유전자는 64kb에 달하는 15 exon spanning으로 구성되어 있다(Donovan 등 1995；Kawarai 등 1997). 이 VNTR의 분석결과 반복 범위(repeat range)가 민족에 따라서 3에서 11 copy로 다양하였고, 차이가 있지만 10copy가 제일 많았고(Doucette-Stamm 등 1995；Nakatome 등 1995；Nakatome 등 1996；Persico 등 1996), 그 다음이 9copy였다(Gelernter 등 1998；Kang 등 1999). 그 외에 40bp VNTR(7 copy)가 활성도가 낮은 ALDH의 아형인 ALDH2*2/2*과 관련이 있다는 결과(Muramatsu 등 1995)와, A9 copy가 알코올 금단 경련등 병의 심각도와 관계가 있다고 하였다(Sander 등 1997). 
   알코올의존 외에도 도파민 수송체와 다른 정신과적 질환과의 연관성은 여러 곳에서 제시되었다.
   Gelernter 등(1994)은 DAT1 유전자형(3’-VNTR의 9 repeated allele)과 cocaine induced paranoia가 강한 연관이 있다는 연구 결과를 발표하였고, Persico 등(1995)은 정신분열병 관련장애와 완전 연관(complete linkage)이 있다고 발표하였다. 
   또한, 주의력 결핍 과잉 행동 장애(ADHD)의 치료 물질인 정신 활성 물질의 약물 작용이 일어나는 곳이 도파민 수송체이기 때문에 도파민 수송체와 ADHD와의 연관성에 관한 연구가 이뤄지고 있다. DAT1의 VNTR, 특히 40bp VNTR이 ADHD와 유의한 연관관계가 있다는 결과가 Cook 등(1994)에 의해 발표되었다. Curran 등(2001)은 480bp VNTR이 주의력 결핍 과잉 행동 장애와 중등도의 연관성이 있다고 하였지만 이형성이 많아서 확실한 결론을 유보하였다. 
   여러 가지 연구결과를 종합하여 볼 때 도파민 수송체와 알코올의존과의 관계는 직접적인 병인은 아닐 수 있어도, 알코올의존과의 연관은 연구의 대상이 될 수 있겠다. 
   국내에서는 세로토닌과 알코올 관련 장애와의 관계에 대한 연구와 도파민 수용체의 다형성, 또 그에 따른 알코올 분해 효소인 ALD와 ALDH의 다형성간의 관계에 대한 연구가 있으나, 도파민 수송체에 관한 연구는 아직 발표된 바가 없다. 이번 연구에서는 3’-UTR의 새로운 VNTR의 좌위인 G2319A의 대립 유전자의 빈도 차이를 정상 대조군과 알코올의존 환자를 비교하였다. 
   G2319A는 DAT1 유전자 중 3’-UTR의 genomic DNA의 염기서열과 cDNA 염기서열을 비교해 봤을때, DAT1 cDNA의 2319 위치에서 단일 핵산 치환이 G에서 A로 일어나는 부분이며, 제한효소 MspI의 작용 부위가 된다. 이 부분을 제한효소로 MspI으로 제거하고, 그 나머지 부분의 다형성을 알코올의존 환자 및 정상 대조군을 대상으로 연합 연구를 시행하였다. 

실험재료 및 방법

1. 연구 대상
   환자군은 1998년에 국립 서울 정신병원에 입원하였던 만성 알코올의존 환자중에서 DSM-IV(American Psychiatric Association 1994) 진단 기준으로 알코올의존으로 진단된 환자 49명과, 정상 대조군은 한림대 한강성심병원 건강검진 센터를 찾은 내원자 CAGE(Cut down, Annoyed, Guilty, Eye open) 점수가 1점 이하이고 AUDIT(Alcohol Use Disorder Identification Test) 점수가 9점이하인 53명을 대상으로 하였다. 환자군과 정상 대조군 모두 18세에서 65세 사이의 남자를 대상으로 하였다. 

2. 혈액채취 및 DNA분리
   혈액 채취 및 DNA 분리는 알코올의존환자와 대조군으로부터 정맥혈 5ml를 말초혈액에서 채취하여 heparine-lithium tube에 넣은 뒤 DNA를 분리를 하기 전까지 -20°C에 보관하였다. 샘플을 녹인 후, 녹은 샘플에 0.1N NaOH 0.2ml에 넣은 후 3분간 끓였다. 그런 후, 증류수 0.4ml를 넣고, phenol extraction (phenol/chloroform 1：1)을 2번하였다. 그 후에, 1/10 부피의 sodium acetate(3M, pH 5.2)넣고, 1/2부피만큼의 ice-cold absolute alcohol을 첨가한 후 -70°C에 10분간 놓아두어 DNA를 침전시켰다. Eppendorf 원심분리기로 14,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 버린 후, 다시 ice-cold 70% alcohol을 첨가하고, 여분의 salt를 제거하였다. 다시 10분간 14, 000rpm에서 원심분리하고 여기서 얻은 DNA pallet를 잘 말린 후 10ul의 증류수에 녹여 순수한 DNA를 얻었다. 이렇게 얻은 genomic DNA 농도를 100ng/ul로 맞추어 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction：PCR)의 주형으로 사용하였다. 

3. Genomic DNA 증폭-PCR
   DNA 염기서열에 있어서 변이는 PCR을 기초로 하는 RFLP 분석방법을 사용하였다(양병환 등 1998). 본 연구를 위해 사용된 primer는 GenBank accession number M95167(Homo sapiens dopamine transporter(SLC6A3))이며, primer의 고안은 Primer Detective program(ClonTech)을 사용하였다. 고안된 sense primer로 5’-CCGTGTCTTG-TGTTGCTGTA-3’와 anti-sense primer로 5’-ACGGGGATTCTCAGCAGGTG-3’를 고안하여 합성하였다. 
   PCR 반응은 양병환 등(1998)에 따라 수행하였다. 즉, DNA 0.1ug/ul를 반응 완충액(10mM Tris-HCL, pH 9.0, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100) 60ul에 10mM dNTPs(Beoringer Maanheim), 2U를 TaqI DNA polymerase, 0.5uM primer를 사용하여, 94°C에서 30초, 57°C에서 30초, 72°C에서 30초간 35 cycle을 반응시키고 72°C에서 5분간 반응하였다. 

4. MspI digestion
   얻어진 PCR 수행산물은 217bp의 DNA fragment를 갖게 되었고, 각각의 PCR 산물을 MspI로 처리하면 137bp와 80bp의 fragment를 나타내었다. 제한효소의 처리는 PCR 산물 40ul에 1U을 MspI를 처리하여 37°C에서 밤새 반응시켰다. 제한효소 처리결과는 20% acrylamide gel 전기영동을 사용하여, 3시간 전개하였다. ethidium bromide 용액에 담근 후 자외선 투광기로 확인하고, 촬영하였다. 사진은 2명의 판독자가 독립적으로 판독하였다. 이 연구에서는 자연형(wild type)을 G, 변형(variant type)을 A로 규정하였다. 
   유전자형 분석은 217bp 위치에 한 개의 띠가 나타나는 경우에 AA로, 137bp와 80bp에 밴드가 있을때는 GG로, 그리고, 217bp, 137bp 및 80bp에 세 개의 밴드가 나타나는 경우를 GA로 판정하였다. 

5. 전기영동-Acrylamide gel running
   MspI로 digestion한 product를 8% polyacrylamide gel에 110V로 1시간 running 시켜 최종적으로 그 결과를 확인하였다. 

6. 통계분석
   통계분석은 알코올 중독자와 정상인간의 대립유전자 및 유전형 빈도는 chi square 분석방법과 Fisher’s extract test를 썼고, SPSS/PC⁺ version 7.5를 이용하였다. λ²-test, Fisher’s extract, probability test등의 통계는 양측검증을 하였고, 통계적 유의 수준은 p<0.05로 하였다. 

결     과

   알코올의존 환자 49명과 정상 대조군 53명의 유전자 빈도와 대립유전자 빈도를 분석한 결과는 표 1에서와 같이 나왔다. 알코올의존 환자 49명의 유전자 빈도는 GG 27명(55%), GA 21명(43%), AA 1명(2%)이었고, 대립유전자의 빈도는 G가 77%, A가 23%였다. 정상 대조군 53명의 유전자 빈도는 GG 11명(21%), GA 39명(73%), AA 3명(6%)이었으며, 대립유전자의 빈도는 G 58%, A 42%로 나타났다. 
   두 군간의 유전자 빈도(λ²＝12.999, df=1, p=0.003)의 차이는 통계적으로 유의한 차이가 있었고, 대립 유전자 빈도(λ²＝8.258, df=2, p=0.004)는 통계적으로 유의한 차이가 있었다. 
   유전자형의 빈도차이를 비교해 본다면, GG 유전자형은 두 집단간에 통계적으로 유의한 차이(λ²＝6.737, df=1, p =0.009)가 있었고, GA 유전자형은 통계적으로 유의한 차이(λ²＝5.400, df=1, p=0.020)가 있었다. AA 유전자형은 sample의 숫자가 너무 적어서 통계처리를 할 수 없었다. 
   대립 유전자 A의 빈도만을 두 군에서 비교해 본다면 통계적으로 유의한 차이(λ²＝7.118, df=1, p=0.004)가 있었다. 대립 유전자 G의 빈도는 두 군간에서 통계적으로 유의미한 차이(λ²＝1.441, df=1, p=0.230)가 없었다. 

고     찰

   본 연구의 결과에서는 유전자형 분포의 차이는 정상 대조군과 환자군 사이에 통계적으로 유의미한 차이가 있었고, GG형과 GA형의 두 군간 차이는 통계적으로 유의미하였다. 대립 유전자 G의 분포 차이는 통계적으로 유의미한 차이가 없었으나, A의 차이는 통계적으로 유의미한 차이가 있었다. 대립 유전자 A는 환자군에서 보다는 정상 대조군에서 더 많이 관찰되었다. 대립 유전자 A와 알코올의존간의 관계를 밝히는 데에는 대립 유전자 A가 어떠한 기전을 통하여 정신과적 질병 즉 표현형(phenotype)에 영향을 미치는지에 대해 논의가 되어야 한다. 
   도파민 수송체 유전자중 전사되지 않는 부분(3’-UTR)이 중요하게 평가되는 이유는 3’-UTR의 유전자적 다형성이 도파민 수송체 기능의 조절 및 변화에 관계되고, 이 변화에 따라서 임상적 표현형이 달라질 수 있기 때문이다. 3’-UTR 범위가 최종산물인 단백질에는 영향을 주지는 않지만 이 부분은 mRNA 위치측정(localization), 전사 안정성(transcript stability), 단백질 합성의 조절에 영향을 줄 수 있다. 그 예로, Goodwin등(1993)이 주장한 3’-UTR의 변이가 조절 단백질(regulatory protein)의 변형을 가져올 수 있다고 한 것과, 3’-UTR의 다형성(polymorphism)중 9 copy를 가진 대상에서는 10 copy를 가진 대상보다 도파민 수송체의 기능이 22%감소한다고 한 것이 이를 뒷받침한다(Heinz 등 2000). 
   Grunhage 등(2000)은 유전자의 조절부분(regulatory reg-ion)과 연관 불균형(linkage disequilibrium)을 가지고 있을 가능성이 있어 도파민 수송체의 기능에 영향을 미친다고 하였으나 이 부분에 대해서는 아직 논란의 여지가 많다. 
   3’-UTR과 알코올의존의 임상적 연관관계는 40bp VNTR의 copy수에 따른 연구가 많이 되어졌다. A9 copy나 A10 copy가 가장 흔하며, 여러 연구에서 알코올의존과의 연관성, 금단 증상, 알코올 금단 경련과 같은 증상과 연관 관계가 있는 것으로 발표 되었다(Sander 등 1997). 그리고, 40bp VNTR은 알코올의존 외에도 과잉 행동성 주의력 결핍 장애와 정신분열병, 강박증, 불안장애, 뚜렛장애등과의 연관성이 있다고 하였다(Cook 등 1994；Curran 등 2000；Rowe 등 1998). 
   Ueno 등(1999)이 일본인을 대상으로 한 G2319A의 대립유전자와 유전자 빈도를 조사한 바에 의하면, 가장 흔한 A10형과 non-A10형을 비교하여, A10의 알코올의존과의 관련 가능성에 대하여 결과를 보고하였다.
   반대로, 도파민 수송체와 알코올의존과의 연관성은 없다는 결론도 있었다(Martinez 등 2001). 하지만, Martinez 등은 도파민 수송체와 알코올의존과의 관계에 대해서, 도파민 수송체가 작용을 하는데, 유전자적 다형성이 도파민 수송체 기능을 조절할 가능성이 있다고 하였다.
   본 연구 결과를 종합해 본다면 A 대립 유전자(allele)의 빈도는 정상 대조군과 알코올의존환자와의 차이가 통계적으로 의미가 있었다. GA 유전형이 정상 대조군에서 많은 빈도를 보이고, A 대립유전자가 정상 대조군에서 많은 빈도를 보였다. 이는 자연형인 G의 변형인 A가 최종적으로 단백질이 되는 도파민 수송체 단백질의 기능을 조절하는 역할을 한다거나, 도파민 수송체의 구조의 안정화 등을 통해서 알코올의존에서 기능을 하고 있다고 가정해 볼 수 있겠다. 하지만 본 연구의 여러 제한점 때문에 이러한 결론은 내리기가 힘들고, 앞서 서술한 바와 같이 A 대립 유전자 하나가 알코올의존에서 어떠한 기능을 한다는 것은 이 연구에서 여러가지 제한점으로 알기 힘들다.
   제한점 중 첫째, 분석 방법의 문제 이다. Ueno 등(1999)이 일본인을 대상으로 한 G2319A의 대립유전자와 유전자 빈도를 조사한 경우에서는 자연형인 G의 빈도가 더 높게 나왔다. Ueno 등(1999)은 분석 방법을 copy수도 고려해서 분석을 하였기 때문에 같은 좌위를 연구한 본 연구와 반대되는 결과가 나왔다고 할 수 있다. 하지만, 본 연구 결과는 같은 좌위를 분석을 하더라도 민족에 따라서 다른 결과가 나올 수 있다는　Kang 등(1999)의 연구와도 결과가 일치한다고 볼 수 있다. Kang 등(1999)은 SLC6A3의 copy수를 민족별 차이와 정신과 질환 즉, 알코올의존, 정신분열병, 주의력 결핍 과잉행동 장애등과 연관에 대한 선행연구들을 종합하여 조사한 결과 10 copy와 9 copy가 가장 흔하였지만, 다른 copy수도 무시하지 못할 정도로 그 차이가 다양하였다고 하였다. 그리고, copy수에 따라서 동일 질환과의 연관관계를 조사한 바에 의하면, 연구 대상이 민족마다 결과가 다르게 나오는 경우가 많았다고 하였다. 
   둘째, 유전자와의 질병과의 관련성을 평가하기 위해서는 알코올의존의 아형(subtype)이나 임상적인 차이를 같이 고려하지 못한점이다. 즉, 알코올의존 환자를 증상의 정도(금단 증상, 음주의 유형), 발생 시기, 가족력의 유무, 다른 정신과적 질환이 같이 있는 경우, 기질(temperament)과의 연관성등으로 나눠서 유전자와 관련성을 평가한다면, 유전자가 알코올의존에서 어떠한 역할을 아는데 용이할 것이다. 
   선행연구에서는 A9과 알코올의존의 심각성이 중증인 것과의 연관을 보여 주고 있고, 특히 알코올 금단과 알코올 금단 경련이 관계되어 있는 경우가 많았다(Sander 등 1997).
   알코올의존의 아형별 SEPCT나 PET 연구는 Cloninger (1991)의 알코올의존 I형, II형이 각각의 결과가 다르게 나왔고, 이 연구 결과는 다른 연구에서도 이 아형에 따라서 I형일 경우에는 도파민 수송체 농도가 선체에서 낮게 나오는 연구 결과가 많았고, II형일 경우에는 결과가 매우 다양하였다.
   기질(temperament)과의 연관성에 대한 연구로 기질-성격 목록(temperament-character inventory：TCI)의 4가지 항목과 도파민 수송체의 유전자적 다형성에 관한 연구는 4가지 항목과는 연관이 특별하게는 없었으나 A9과 A10과 차이가 있음을 서술하였다. A9이 낮은 novelty seeking을 보인다는 결과가 있다(Sabol 등 1999). 국내에서는 이정식등(2000)이 조사한 단가아민 산화제(Monoamine oxidase)ACA 반복 유전자 다형성과 알코올의존 환자의 특징적인 음주 양상이나 공격성등의 행동특성들과의 관련성은, 유전자 다형성이 음주양상을 변화시킬 수 있는 가능성을 보여주었다. 
   그리고, 인구학적인 제한점은 표본의 수가 너무 적다는 점과, 알코올의존환자와 정상 대조군과의 연결(match)이 이뤄지지가 않았다는 점과, 알코올의존 환자군이 균질성이 떨어진다는 점이 있다. 환자군의 나이나 병을 앓아온 기간 등이나 알코올의존의 심각도(금단 증상, 경련의 유무)를 고려하지 못한 한계점이 있다고 하겠다. 분석의 대상이 남자로만 되어 있다는 것은 선택 편이(selection bias)라는 단점이 있을 수 있겠지만 유전적으로나 생물학 적으로는 좀 더 균등한 표본이므로 장점이 될 수 있다. 
   끝으로, 환자 집단과 정상 대조군간의 유전자 다형성을 분석하는데 copy 수까지 비교하였다면 선행 연구(Ueno 등 1999)인 일본인 집단과의 차이를 비교할 수 있었을 것이고, 알코올의존의 임상 유형별, 환자 기질 별 비교 등이 좀 더 이뤄진다면 자세한 결과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다.