Korean Journal of Biological Psychiatry

교신저자：이민수, 136-705 서울 성북구 안암동 5가 126-1
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서     론

   알코올 중독은 다양한 정신과적 그리고 의학적 문제들과 관련이 있는 이질적인 장애로서 다양한 병태생리가 제시되고 있는데, 그 중에서도 유전적인 요소에 대한 다양한 동물실험, 가족연구, 쌍생아 연구 및 양자연구들이 시행되었다(Cloninger 등 1981；Goodwin 1979；Merikangas 1990). 그러나 알코올 의존과 특정한 유전적 표지자와의 연관성을 연구하기 위해 광범위한 분자생물학적 연구들이 시도되었음에도 불구하고 알코올 중독에 대한 분자단위의 관련근거는 아직 명확하게 제시되지 못하고 있다.
   도파민은 중뇌, 측 중격핵(nucleus accumbens)과 전두피질에 위치한 변연계 및 중변연계 보상 경로에서 주된 역할을 하며, 이러한 보상 경로들은 약물 강화와 쾌락추구 행동에 중요한 것으로 생각된다(Koob과 Bloom 1988；Moolten과 Kornetsky 1990；Strange 1993；Wise와 Rompre 1989). 도파민은 또한 정신분열증과 운동 기능이상에서도 중요한데, 이러한 장애에서 도파민 수용체를 차단시키는 약물의 치료적 효과 때문이다. 현재까지 다섯 개의 도파민 수용체 유전자들이 분리되었고(Meador-Woodruff 1994), 알코올 중독과 도파민 D2 수용체의 A1 대립유전자(allele) 연관성을 보고한 일부 연구들이 있다(Arinami 등 1993；Blum 등 1990).
   도파민 D4 수용체는 G-단백결합 수용체군에 속하고, 원숭이 뇌에서 이 수용체의 mRNA 농도는 전두피질, 중뇌, 편도, 연수에서 가장 높고 기저핵과 후결절(olfactory tubercle)에서는 낮게 관찰된다(De Keyser 1993；Van Tol 등 1991). 도파민 D4 수용체의 약리학적인 특성은 도파민 D2와 D3 수용체의 특성과 유사하지만, 도파민 D4 수용체는 비전형적인 신경이완제인 clozapine 및 동종의 octoclothepin과 결합하는데 도파민 D2 혹은 D3 수용체보다 10배 이상의 친화성을 가진다(Van Tol 등 1991). 도파민 D4 수용체와 D2 수용체의 구조적인 상동성은 도파민 D4 수용체가 Gi 혹은 Go-단백질을 경유하여 신호를 보내고, adenyl cyclase 활성을 억제한다는 것을 시사한다(De Keyser 1993；Strange 1993). 그렇지만, 도파민 D4 수용체의 특이한 기능은 아직 알려져 있지 않다. 도파민 D4 수용체 유전자는 높은 다형성(polymorphism)을 나타내고 이러한 다형성은 유전자의 exon III에서 다양한 수의 48bp 반복서열(repeats)(2에서 8 혹은 10)에 의해 특성이 부여된다(Lichter 등 1993). 실험실 연구에서 도파민 D4 수용체의 다양한 반복서열 형태들이 서로 다른 결합친화도를 보이는데, 이는 도파민 D4 수용체 대립유전자들이 기능적으로 다르다는 것을 제시한다(Van Tol 등 1992). 따라서 대뇌에서 도파민과 약물강화 및 쾌락추구행동과의 관련성을 고려할 때, 이러한 도파민 D4 수용체 유전자의 다형성이 유전적으로 알코올 중독을 포함하는 행동장애의 감수성을 결정할 수도 있다는 것이다. 지금까지 도파민 D4 수용체 48bp 반복서열 대립유전자들과 알코올 중독의 연관성에 대한 다수의 연구가 시행되었다. 알코올 중독군과 대조군의 전반적인 연관성의 비교, 알코올 중독의 아형에 따른 연구, ALDH2 (aldehyde dehydrogenase 2 gene)의 변이에 따른 연구 그리고 성격특성과 관련지은 연관성에 대한 연구가 현재까지 진행되고 있으나 그 결론은 내리지 못하고 있는 실정이다(Adamson 등 1995；Bau 등 2001；Chang 등 1997；George 등 1993；Hill 등 1999；Muramatsu 등 1996；Sander 등 1997；Sullivan 등 1998).
   본 연구는 정신과적 면담을 통하여 진단된 67명의 한국인 알코올 중독환자에서 도파민 D4 수용체의 48bp 반복서열 대립유전자 다형성이 알코올 중독과 연관성이 있는지를 밝혀보기 위해서 실시되었다.

연구대상 및 방법

1. 연구대상
   연구대상은 고려대학교 부속병원 정신과, 부산대남병원에서 DSM-Ⅳ(APA 1994) 진단기준에 의하여 알코올 의존으로 진단된 67명의 남자 환자를 대상으로 하였고, 기분장애, 정신분열증 그리고 기타 정신병적 장애를 가진 사람은 제외하였다.
   정상대조군은 발달과정에서 정신질환의 가족력이 없고, 두부외상 및 신경학적 질환력이나 알코올 중독 또는 약물남용의 과거력이 없는 사람들 중 연구 목적과 방법을 설명하여 자발적으로 참여한 건강한 남자 67명을 대상으로 하였다. 양군 모두에서 병력, 이학적 검사, 신경학적 검사 상 이상소견은 없었다. 대조군의 연령분포는 환자군과 차이가 없도록 구성하였다.

2. 연구방법

1) Genomic DNA의 정제
   말초 혈액 1.5ml를 13,000rpm에서 1분간 원심분리하여 혈청을 제거하고, 남은 pellet에 ACE shocking solution(NH₄Cl 8g, Na₂EDTAH₂O 1g, KH₂PO₄ 0.1g을 증류수 1l에 녹인 용액)을 500μl을 넣고 서서히 3분간 흔들어 적혈구를 제거한다. 상기 과정을 2회 반복한다.
   상층막을 깨끗이 제거한 후 남은 pellet에 400μl의 nucleic lysis Buffer[Tris(pH8.0) 10mM, NaCl 400mM, EDTA 2mM]를 넣고 pellet을 잘 섞어준다. 여기에 10% SDS 27μl와 proteinase K 10μl를 첨가하고 56°C에서 2시간 동안 반응시키고 saturated NaCl 135μl를 넣고 상온에서 15분간 방치한다. 13000rpm에서 1분간 원심분리한후 상층액을 새 관에 옮긴 후 2배 부피의 에탄올에 넣고 침전된 DNA를 회수하여 새 관에 옮긴다. 이 DNA를 70% 에탄올로 세척한 후 건조시키고, 증류수 100μl에 녹인다.

2) 중합효소연쇄반응을 이용한 유전자형의 판별
   도파민 D4 수용체 유전자에서 다형성을 보이는 부위에 대해 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction：PCR)을 시행하였으며 도파민 D4 수용체 유전자좌를 분석하기 위해 사용한 시발체의 염기배열순서는 다음과 같다.
   D4-3：5’-GCG ACT ACG TGG TCT ACT CG-3’
   D4-42：5’-AGG ACC CTC ATG GCC TTG-3’

   PCR은 50μl의 반응용량으로 35주기를 수행하였고 반응조건은 다음과 같다.

   반응온도와 시간은 94°C에서 5분간 1주기를 수행한 후 94°C에서 30초, 58°C에서 30초, 72°C에서 30초간 각각 35주기를 수행하였고, 마지막으로 72°C에서 5분간 1주기를 수행하였다.

3) 증폭된 생성물의 분석
   도파민 D4 수용체 유전자에 나타나는 48bp 반복서열을 분석하기 위해 5% poly acrylamide 겔에서 전기영동한 후 ethidium bromide 용액으로 염색하여 자외선 투사기(ultraviolet transilluminator)에서 관찰하고 polaroid 카메라(polaroid, film 667)로 촬영하였다.

4) 증폭된 생성물(PCR product)의 크기
   Size of product：474bp 522bp 570bp 618bp 666bp 714bp

3. 통계분석
   본 연구에 참여한 알코올 중독환자들의 도파민 D4 수용체 유전자형과 대립유전자 빈도를 정상대조군과 Chi-square 검증을 시행하여 비교 분석하였다.

결     과

1. 환자의 특성
   환자군의 연령 분포는 27~70세이었으며 평균 46.49(±9.28)세이었고, 정상대조군의 연령분포는 27~67세이었으며 평균 46.40(±9.14)세로 양군간의 유의한 차이는 없었다(표 1).
   환자들은 다양한 유형의 음주 성향을 보였으며, 모든 환자가 연구 당시 다양한 종류의 항우울제 및 항불안제 등의 향정신성 약물을 복용하고 있었다.

2. 도파민 D4 수용체 유전자좌의 분석결과
   환자군(67명)에서의 도파민 D4 수용체 대립유전자 빈도를 보면 4-repeat 대립유전자의 빈도가 96명(71.6%)으로 가장 높았으며, 대조군의 경우도 4-repeat의 경우가 101명(75.4%)으로 가장 높았다. 다음으로 2-repeat 대립유전자의 빈도가 환자군에서는 31명(23.1%)이었고 대조군에서는 27명(20.1%)이었다. 5-repeat 대립유전자는 환자군에서 6명(4.5%)이었고 대조군에서는 5명(3.7%)이었다. 3-repeat의 경우는 환자군 및 대조군 각각 1명(0.7%)이었다. 이상 각 대립유전자의 빈도는 환자군과 대조군사이에 유의한 차이를 보이지 않았다(표 2).
   도파민 D4 수용체의 유전자 표현형은 2/2, 2/4, 2/5, 3/4, 4/4, 4/5 등으로 각각의 환자군 및 대조군에서의 빈도는 표에 제시되었다(표 3). 유전자 표현형 역시 환자군과 대조군 사이에 유의한 차이를 보이지 않았다.

고     찰

   최근의 연구들은 적어도 알코올 중독에 대한 취약성의 일부가 유전된다는 증거를 제시해왔다(Devor와 Cloninger 1989；Gelernter 등 1993；Goodwin 1991；Gordis 등 1990). 알코올 의존과 알코올 남용에 대한 취약성은 원인적으로 복잡하다. 환경적인 요인 뿐 아니라 유전적인 기여 부분도 복잡할 것으로 생각된다(Gordis 등 1990；Holden 1991). 중추신경계의 보상경로에서의 도파민의 연관성을 고려할 때, 도파민 신경전달과 관련된 유전자들의 표현에서의 개인간의 차이들이 알코올 중독의 유전적인 취약성과 관련될 수 있을 것이다.
   알코올 중독의 유전적 감수성이 도파민성 신경전달과 관련이 있다는 가정 하에 도파민 D4 수용체를 포함한 도파민 수용체 유전자에 대한 연구가 진행되었는데, 특히 도파민 D2 수용체에 대한 많은 연구들이 있다(Blum 등 1990；Cloninger 1991；Comings 등 1991；Noble 등 1992；Parsian 등 1991). Blum 등(1990)은 35명의 알코올 중독자가 대조군보다 더 많은 빈도의 도파민 D2 수용체 A1 대립유전자를 가지고 있음을 보고하였으나 적은 표본, 환자와 대조군의 이질적인 유전적 배경, 그리고 의무기록에 의존한 후향성 진단 등이 비판을 받았다(Bolos 등 1991；Gelernter 등 1993；Goldman 등 1991；Turner 등 1992). 결국, 전반적으로 이러한 도파민 D2 수용체와 알코올 중독과의 연관성은 지속적으로 뒷받침되지 못해왔다는 것이다. 도파민 D3 수용체의 대립유전자의 관련성에 대한 연구는 상대적으로 적었는데, 일부 섬망과 관련된 알코올 의존환자군에서 A1 대립유전자가 유의하게 많았음을 보고한 한가지 결과 외에는 도파민 D3 수용체에서 어떠한 대립유전자 연관성도 발견되지 않았다(Gorwood 등 1995；Parsian 등 1997；Sander 등 1995).
   본 연구에서 한국인의 경우 도파민 D4 수용체 다형성은 알코올 중독환자나 정상대조군 모두 4-repeat와 2-repeat의 대립유전자의 빈도가 상대적으로 높은 것으로 나타났다. 일본인과 대만인을 대상으로 한 이전의 연구에서도 환자군이나 대조군 모두 4-repeat와 2-repeat 대립유전자 빈도가 상대적으로 높은 것으로 나타났다(Chang 등 1997；Muramatsu 등 1996). Adamson 등(1995)의 핀란드인을 대상으로 한 연구에서는 4-repeat 만이 환자군 및 대조군 모두에서 상대적으로 높은 빈도를 보였고 Sander 등(1997)의 독일인을 대상으로 한 연구에서는 4-repeat와 7-repeat 대립유전자 빈도가 상대적으로 높은 것으로 나타났다. 이와 같이 도파민 D4 수용체 대립유전자들은 빈도에 있어서 집단간에 차이를 나타낼 가능성이 있지만, 도파민 D2 수용체 대립유전자에서 관찰된 것보다는 작을 것이라고 한다(Barr와 Kidd 1993). 앞서 비교한 본 연구와 다른 연구들에서의 도파민 D4 대립유전자 빈도는 집단간의 차이에 대한 이러한 사실을 어느 정도 확인할 수 있었다. 
   알코올 중독과 도파민 D4 수용체 다형성의 연관성에 관련해서 미국에서의 연구(Parsian 등 1997), 핀란드인을 대상으로 한 연구(Adamson 등 1995) 그리고 대만인구에서 3개의 집단을 대상으로 한 연구(Chang 등 1997) 등에서 그 연관성을 찾는데 실패했다. 그러나 George 등(1993)은 기존의 연구들에서 이태리계 백인, 캐나다계 백인, 일본인 등을 대상으로 하여 도파민 D4 수용체의 repeat-3과 repeat-6의 대립유전자가 알코올 중독과 유의하게 상관관계를 가지는 것으로 보고하였다. 그렇지만, 이 연구에서는 집단간의 편차에 영향을 줄 수 있는 연구 대상에 문제가 있었다. 본 연구에서는 알코올 중독환자와 정상대조군은 도파민 D4 수용체의 대립유전자 및 유전자 표현형의 빈도에서 차이를 보이지 않았다. George 등(1993)의 연구에서는 repeat-6 대립유전자가 알코올 환자에서 4배나 많은 빈도를 보였지만, 본 연구에서의 한국인 대상들에서는 repeat-6 대립유전자가 환자군과 대조군 모두에서 1명도 없었고 Adamson 등(1995)의 연구에서도 이 대립유전자는 환자군에서만 1명이었고 대조군에서는 1명도 없었다. 즉, 알코올 중독에서 이러한 드문 도파민 D4 수용체 대립유전자의 연관성에 대한 George 등(1993)의 결과는 민족적으로 일치하지 않는 대상의 사용이라는 제한점과 맞물려 있다.
   그런데, 이러한 도파민 D4 수용체 다형성과 관련된 다른 긍정적인 연구들이 있는데, 그 중 하나가 Muramatsu 등(1996)의 일본인을 대상으로 한 연구이다. 이 연구는 알코올 중독의 발생에 대하여 보호요소(protective factor)로 간주되는 ALDH2를 가진 80명의 알코올 중독 환자들에서 48bp D4 다형성의 5-repeat 대립유전자의 빈도가 유의하게 높았음을 보고하였다. 또 다른 긍정적인 결과는 Kotler 등(1997)의 연구로서 어떤 성격적인 기질(novelty seeking)이 아편 중독 환자군에서 특정 D4 대립유전자(주로 7-repeat로 표현되는)와 연관성이 있는 것으로 보고되었다. 그러나, 이러한 결과에 기초하여 알코올 중독 환자들에서 시행한 일련의 연구들에서는 알코올 중독 환자들에서의 이러한 성격적인 기질과 특정 D4 대립유전자와의 연관성을 명확하게 확인하지 못하였다(Bau 등 1999；Bau 등 2001；Sander 등 1997；Sullivan 등 1998).
   결론적으로 본 연구를 포함한 지금까지의 연구들은 도파민 D4 48bp 반복서열 다형성이 알코올 중독과 관련이 있다는 결론을 이끌어 내지는 못했지만, ALDH2 보호요소와 특정 성격적인 기질과 같은 변수들 그리고 알코올 중독의 정신병리와 도파민관련 행동과의 연관성을 생각할 때 아직 결론을 내리기는 어려울 것이다. 또한 48bp 반복서열의 기초 하에서 다른 도파민 D4 수용체 다형성이 제기되어 알코올 중독에 대한 유전적 감수성에 대한 새로운 결론이 나올 수도 있을 것이다. 따라서 향후 알코올 중독의 심각도, 정확한 진단적 평가, 종족간의 차이, 다양한 유전적 변이, 다른 특이한 취약성의 요소 및 다른 행동학적 장애와의 관련성을 고려하여 보다 체계화된 연구가 필요할 것이다.