Korean Journal of Biological Psychiatry

교신저자：박진경, 130-702 서울 동대문구 회기동 1
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서     론

   정신분열병은 다양한 정신기능에 이상을 초래하는 질환으로서, 증상뿐만 아니라 경과, 치료, 반응 및 예후가 매우 다양하다. 병의 원인으로 뚜렷하게 밝혀진 것은 없으나, 생물학적 그리고 사회심리학적인 여러 요인들이 정신분열병의 발생에 복합적으로 작용할 것으로 추정하고 있다. 기존의 연구들을 통해 유해산소(free radical)에 의한 중추신경계의 이상이 정신분열병의 병태생리에 관여하는 것으로 제시되어왔다.¹⁾
   Free radical이란 산소원자나 분자에 부대전자가 존재하는 reactive oxygen을 말하는 것으로 호기성 대사에 의해 생겨나며, superoxide(O2-), hydroxyl ion(·OH), hydrogen peroxide(H2O2), nitric oxide(NO)등과 같은 물질들이 여기에 포함된다. 이러한 물질들이 과도하게 생산되거나 antioxidant defense system에 이상이 있을 경우 세포손상이 일어나게 되며, 주로 세포막에 있는 phospholipid의 peroxidation에 의해 일어나게 된다.²⁾
   인체에는 superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(GSHPx), catalase(CAT)와 같은 항산화 효소들(antioxidant enzymes)이 있으며 이것들이 작용하여 free radical에 의한 연쇄반응을 차단하게 된다. SOD는 O₂^-를 H₂O₂로 전환시키며, 이렇게 형성된 H₂O₂는 CAT와 GSHPx에 의해 H₂O와 O₂로 분해된다.³⁾ 뇌조직 내에는 CAT와 GSHPx의 농도가 감소되어 있고, SOD의 농도가 증가되어 있는 것으로 알려져 있으며, free radical의 작용에 민감한 polyunsaturated fatty acids(PUFAs)의 양이 다른 조직에 비해 많은 것으로 알려져 있다. 이러한 이유들로 인해 뇌조직은 free radical에 의한 세포독성에 매우 취약한 것으로 알려져 있다. 
   기존의 연구들을 통해 정신분열병 환자의 뇌에는 PUFAs와 phospholipid의 양이 감소되어 있는 것으로 보고되고 있으며,⁴⁾ 이것은 free radical에 의한 lipid peroxidation의 증가에 의한 것으로 추정되고 있다.⁵⁾⁶⁾⁷⁾ 정신분열병 환자의 antioxidant enzyme의 농도는 일반인과 다른 것으로 보고가 되고 있으며,^8)9)10) 또한 정신분열병의 아형이나 치료 및 경과에 따라 차이를 나타내고 있는 것으로 알려져 있다.^9)11)12) 이러한 결과들은 free radical에 의한 뇌신경의 손상이 정신분열병의 발병 및 경과에 중요한 영향을 주고 있다는 것을 시사한다. 
   정신분열병과 antioxidant enzyme의 관련성에 관한 연구는 대부분 이들의 혈중농도나 활성도 및 free radical에 의한 대사산물의 농도를 측정하는 것들이었으며, 이들의 유전자형에 관한 연구는 부족한 상태이다. 본 연구에서는 11번 염색체의 p13영역에 위치해 있는 CAT 유전자의 다형성을 분석하여 이 유전자의 다형성과 정신분열병의 유전학적 관련성 및 antioxidant enzyme과 정신분열병과의 관련성 여부를 보고자 하였다. 

연구 대상 및 방법

1. 연구 대상
   환자군은 국내 한 정신병원에 입원하고 있는 환자 중 DSM-IV¹³⁾의 진단기준 상 정신분열병의 기준을 만족시키고, 다른 신체 질환이나 정신과적 질환이 없는 사람을 대상으로 하였다. 환자군의 총 수는 167명으로 남자가 91명, 여자가 76명이었다. 평균연령은 41.9±11.0세였다. 환자군은 DSM-IV¹³⁾의 진단기준에 따라 5개의 아형으로 나누었으며, paranoid type이 76명, disorganized type이 19명, catatonic type이 1명, undifferentiated type이 55명, residual type이 16명으로 구성되어졌다. 대조군은 건강진단센터를 방문한 사람 중 정신과 질환의 과거력 및 가족력이 없는 정상인을 대상으로 하였다. 대조군의 총 수는 155명으로 남자가 95명, 여자가 60명이었다. 평균연령은 39.6±9.6세였다. 환자군과 대조군에서 남녀 성비나 연령분포에 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 

2. 연구 방법

1) 혈액채취 및 DNA 추출법
   환자군과 대조군에서 정맥혈 3ml를 채혈하여 EDTA tube에 넣어 응고를 방지한 다음 DNA를 추출하기 전까지 -20°C에 보관하였다. DNA 추출은 DNA Isolation Kit(Roche, Manheim, Germany)를 이용하였다. 2ml의 혈액에 적혈구융해완충액 6ml를 가하고 잘 섞은 후 10분간 원심 분리하여 상층액은 버리고, 백혈구융해완충액 900ul와 RNase 2ul를 가한 다음 37°C 배양기에 10분간 놓아두었다. 그 후 1.5ml tube로 옮긴 후 단백질침전용액 468ul를 넣고 잘 섞은 후 10분 동안 원심분리 하였다. 상층액을 새로운 tube로 옮긴 후 isopropranolol 650ul를 넣고 침전물이 생길 때까지 잘 섞은 후 10분 동안 원심분리 하였다. 상층액을 버리고 70% ethanol 900ul로 DNA를 세척한 후 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고 말린 후 TE완충액 100ul에 녹여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 PCR)에 사용하기 전까지 -20°C에서 보관하였다. 

2) DNA의 중합효소 연쇄반응
   본 연구를 위해 사용된 primer는 CAT 유전자의 promoter부위를 포함하는 부분이며, Ukkola 등(2001)에 의하여 제시된 방법으로 합성하여 사용하였다. Sense primer의 염기서열은 5’-AATCAGAAGGCAGTCCTCCC-3’, antisense primer의 염기서열은 5’-TCGGGGAGCACAGAGTGTAC-3’로 합성하였다. DNA 증폭을 위한 PCR은 추출된 100ng/ul의 DNA 1ul에 10×PCR 완충용액(pH 8.3, 100mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15mM MgCl2) 3ul, 2.5mM dNTP 1ul, 10pM primer 각 1ul, Taq DNA polymerase(Biotool, USA) 0.2ul(5U/ul), 3차 증류수 22.8ul를 혼합하여 총 30ul를 만든 후 Master cycler gradient(Eppendorf, Hamburg, Germany)에서 시행하였다. 온도주기는 94°C에서 5분을 유지한 후 denaturation은 95°C에서 30초, annealing은 65°C에서 30초, extension은 72°C에서 1분으로 40회 반복한 후 extension을 극대화하기 위해 72°C에서 5분을 유지하였다. 증폭된 PCR 산물의 크기는 250bp로 ethidium bromide가 포함된 2% agarose gel에서 전기영동시킨 후 UV transilluminator 위에서 밴드로 확인하였다. 

3) 유전자형의 판별
   제한효소 HinfⅠ에 의한 Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP)에 의해 유전자형이 분류되었다. PCR 산물 10ul에 제한효소 HinfⅠ(Roche, Germany) 0.2ul, 효소완충용액 3ul, 3차 증류수 16.8ul를 혼합하여 총 30ul를 만든 후, 37°C에서 4시간 동안 처리한 후 ethidium bromide가 포함된 2% agarose gel에서 전기영동하여 UV transilluminator 위에서 DNA 밴드의 위치를 관찰하였다. 제한효소 HinfⅠ에 절단되지 않는 경우의 250bp 단일밴드(HH homozygote), 절단되는 경우의 177/73bp의 이중밴드(hh homozygote), 그리고 250bp와 177/73bp가 모두 나타나는 삼중밴드(Hh heterozygote)의 3가지 유전자형을 구분할 수 있었다(그림 1). 

3. 통계 분석
   정신분열병 환자군과 정상 대조군 사이의 catalse 유전자형과 대립유전자형 발현빈도에 대한 비교와 유의성 검증은 Hardy-Weinberg equilibrium의 예측치와 chi-square 검증으로 시행하였다. 통계프로그램은 Statistic Analysis System(SAS) program을 이용하였고, 유의수준은 p<0.05로 하였다. 

결     과 

   본 연구의 정신분열병 환자군과 정상대조군의 CAT 유전자형 빈도(genotype frequency)와 대립유전자형 빈도(allele frequency)를 표 1에 나타내었다. 유전자형의 분포는 Hardy-Weinberg equilibrium의 예측치와 차이가 없었다. 
   HinfⅠ RFLP결과 정신분열병 환자군과 정상대조군과의 비교에서 유전자형의 빈도(χ²=1.205, df=2, p=0.548)와 대립유전자의 빈도(χ²=0.000, df=1, p=1.000) 사이에 통계적으로 의미 있는 차이는 발견되지 않았다. 
   남성 정신분열병 환자군과 남성 정상 대조군과의 비교에서 유전자형의 빈도(χ²=2.205, df=², p=0.332)와 대립유전자의 빈도(χ²=0.012, df=1, p=0.912) 사이에 차이가 없었으나, 여성 정신분열병 환자군과 여성 정상 대조군과의 비교에서 유전자형의 빈도(χ²=11.096, df=2, p=0.004)는 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다. 하지만 대립유전자의 빈도(χ²=0.023, df=1, p=0.881)는 차이가 없었다. 
   남성 정상 대조군과 여성 정상 대조군을 비교해 본 결과 유전자형의 빈도(χ²=2.205, df=2, p=0.332)와 대립유전자의 빈도(χ²=0.015, df=1, p=0.912) 사이에 차이가 없었다. 남성 정신분열병 환자군과 여성 정신분열병 환자군의 비교에서는 유전자형의 빈도(χ²=5.949, df=2, p=0.051)와 대립유전자의 빈도(χ²=0.019, df=1, p=0.891)에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내지는 않았지만 높은 빈도를 보이는 것으로 나타났다.
   정신분열병 환자군의 각아형과 정상 대조군과의 비교에서는 모두 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다(paranoid type vs. control, p=0.905；disorganized type vs. control, p=0.645；catatonic type vs. control, p=0.485；undifferentiated type vs. control, p=0.611；residual type vs. control, p=0.653). 

고     찰

   본 연구에서 정신분열병 환자군과 정상 대조군 사이에 CAT 유전자의 유전자형과 대립유전자 분포에 있어서 차이를 발견할 수 없었지만, 여성 정신분열병 환자군과 여성 정상 대조군 사이의 유전자형에서는 통계적으로 의미 있는 차이를 발견할 수 있었다. 또한 남성 정신분열병 환자군과 여성 정신분열병 환자군 사이의 유전자형 분포에 있어서도 남녀간의 차이가 나는 경향이 있는 것으로 나타났다. 이 결과는 CAT의 활성도가 남성 정신분열병 환자군과 남성 정상 대조군, 여성 정신분열병 환자군과 여성 정상 대조군 사이에서 의미있게 차이가 난다는 다른 연구에서의 결과와 유사하다.⁸⁾ 본 연구의 결과는 CAT 유전자의 HinfⅠ다형성이 여성의 정신분열병과 관련될 수 있음을 시사한다고 하겠다. 
   여러 연구들을 통해 정신분열병 환자들의 antioxidant enzyme 활성도가 정상 대조군과 다르다는 결과가 보고되었다.^9)10)14)15) 이러한 결과들은 정신분열병의 병태생리에 free radical 및 이와 관련된 antioxidant enzyme 등과 같은 antioxidant defense system이 작용할 수 있다는 가능성을 제시한다. Herken 등⁸⁾은 정신분열병의 각 아형간에 antioxidant enzyme의 활성도에 차이가 있다는 결과를 보고하였는데, 이 연구에 의하면 residual group에서의 SOD활성도는 paranoid group에 비해 의미있게 높았으며, CAT활성도는 disorganized, paronoid, residual group모두에서 정상대조군 보다 높은 것으로 나타났다. 또한 GSHPx활성도는 disorganized와 residual group에서 높은 것으로 나타났다. 본 연구에서도 CAT유전자형의 분포를 정신분열병 각 아형간에 비교해 보았지만 의미 있는 차이를 발견할 수는 없었다. 하지만 각 아형에 해당하는 대상환자군의 수가 적어서 이러한 결과가 나왔을 가능성이 있으며, 향후 연구에서 대상환자군의 수가 증가된다면 의미 있는 차이를 발견할 수 도 있을 것이라고 생각된다. 
   정신분열병과 free radical 및 antioxidant defense system의 관계는 치료에 쓰인 약물 및 만발성 운동장애(tardive dyskinesia)와 관련하여 많이 연구되어져왔으며,^12)16)17)18) 이러한 연구들을 통해 vitamin E나 vitamin C와 같은 항산화제(antioxidant)가 약물로 인한 부작용의 예방 및 치료에 쓰일 수 있다는 것이 제시되어 왔다.^19)20)21) 또한 정신분열병의 경과에 따라 antioxidant defense system에 변화가 있다는 연구를 통해⁹⁾ 이것이 정신분열병의 경과 및 예후와 관련성이 있다고 제시되었으며, antioxidant를 치료의 초기에 함께 투여하여 정신분열병의 악화와 재발을 예방하는데 도움을 줄 수 있다는 것이 제시되었다.¹⁾ 본 연구의 결과는 antioxidant enzyme과 정신분열병과의 관계를 밝혀내어 정신분열병의 예방 및 치료에 antioxidant가 사용되고 있는 것에 대한 근거를 지지해 준다고 할 수 있겠다. 
   본 연구의 제한점으로는 CAT 유전자의 일부 다형성만을 분석한 점, 유전적인 연구에서 제안되는 연구대상 규모로는 대상 환자군의 수가 적었던 점 등을 들 수 있겠다. 또한 의미 있는 결과에 대해서 위양성이 나타났을 가능성도 완전히 배제할 수 없다. 위양성은 여러 민족이 다양하게 존재하는 인구집단의 경우 문제가 될 수 있으나, 우리나라는 단일민족이므로 이러한 가능성은 떨어진다고 할 수 있으며, 대단위 인구집단을 대상으로 한 연구 및 여러 연구에서 반복적으로 증명된다면 의미 있는 결과로 해석될 수 있겠다.²²⁾
   본 연구에서 정신분열병과 CAT유전자형의 관계에 있어서 의미 있는 관련성을 발견하지는 못했지만 향후 SOD, GSHPx와 같은 다른 antioxidant enzyme에 관한 연구를 통해 정신분열병과 antioxidant enzyme의 관련성을 살펴보는 것도 의미가 있을 것이라고 생각된다. 

요     약

   본 연구에서는 정신분열병과 antioxidant defense system사이의 관련성을 알아보기 위해 항산화 효소(antioxidant enzyme)중의 하나인 CAT의 유전자 다형성을 한국인 정신분열병 환자군과 대조군 사이에서 비교 분석하였다. 환자군과 대조군의 HinfⅠ 다형성에 따른 CAT 유전자형과 대립유전자형의 빈도는 통계적으로 유의한 차이는 없었지만, 여성 정신분열병 환자군과 여성 대조군 사이의 유전자형 빈도에서는 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다. 연구결과 CAT유전자가 여성 정신분열병과 관련이 있을 수 있다는 가능성이 제시된다.