Korean Journal of Biological Psychiatry

교신저자：정주호, 130-701 서울 동대문구 회기동 1
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서     론

   양극성 장애는 만성적 경과를 보이는 주요 정신 질환의 하나로 우울장애, 정신분열병과 함께 정신과 입원환자의 가장 많은 비율을 차지하는 대표적인 질환이다. 질병의 원인과 발생기전으로 뚜렷하게 밝혀진 것은 없으나 여러 생물학적·유전학적인 가설들이 제시되어 왔다. 세로토닌 등 생체합성 아민의 역할이 광범위하게 연구되어 왔으며,¹⁾ 아직 정확히 규명되지는 않았지만 감염성 병인에 의해서 질환의 원인이 일부 설명될 수 있다는 증거들이 제시되어 왔다.²⁾ 이 질환의 발병에 유전적 요인도 중요한 역할을 하는 것으로 알려지고 있으며 과거 가계도 연구,³⁾ 쌍생아 연구,⁴⁾ 양자연구⁵⁾ 결과들이 간접적으로 이를 뒷받침하고 있다. 그러나 여러 분자유전학적 연구에도 불구하고 유전인자나 유전적 전달 방식 등에 관계된 만족할 만한 결과들이 제시되지 못하고 있는 상태이다.⁶⁾
   최근에는 양극성 장애의 원인으로 추정되는 후보 유전자들과 유전적 표지자에 대한 연합 및 연관에 대한 연구로 직접적인 원인 유전자를 밝히려는 노력이 계속되고 있다. 또한 뇌 영상학과 분자생물학의 발달로 이 질환에서 뇌 구조와 기능의 변화가 보고되고 있으며 이는 신경발달학적 이상을 시사하는 것으로 생각된다.⁷⁾
   최근, 정신과 질병이 신경세포발달 이상과 연관이 되어 있으며 이러한 사실이 세포사멸(apoptosis)에 의해서 설명될 수 있다는 다양한 연구 결과가 보고되고 있다.⁸⁾⁹⁾ Apo-1/Fas(CD95)는 신경발달 이상과 연관된 세포사멸을 담당하는 유전자 중의 하나로서 알려져 있으며 양극성 정동장애의 병인과 관련된 후보 유전자 중의 하나로 생각된다. 사람에게서 Apo-1/Fas(CD95)의 유전자 구조와 promotor부위가 밝혀졌고,¹⁰⁾¹¹⁾ 5' flanking 부위에 두 군데의 유전자 다형성 부위가 확인되었다.¹²⁾
여러 연구에서 세포사멸과 신경발달 이상의 관련성이 제시되었음에도 불구하고 현재까지 Apo-1/Fas(CD95)유전자와 양극성 장애와의 관련성에 대한 연구는 없었기에, 본 연구에서는 양극성 정동장애와 Apo-1/Fas promoter 유전자 다형성의 연관성을 알아보고자 하였다.

방     법

1. 연구대상
   환자군은 서울에 위치한 2개 정신병원, 국립서울병원 및 인제대학교 의과대학 상계 백병원 정신과에 입원하고 있는 환자들 중 DSM-Ⅵ(American Psychiatric Association, 1994)에 근거하여 양극성 장애 기준에 부합하고 다른 신체 질환이나 신경학적인 질환이 없는 환자를 대상으로 하였으며, 모든 환자에게서 서면으로 동의를 받았다. 환자군은 총 81명으로 남자가 48명(59%), 여자가 33명(41%)으로 평균 연령은 34.6±8.7세였다.
   정상대조군은 건강 진단 센터를 방문한 사람 중 지원자를 대상으로 하였고 다른 신체 질환이나 정신 질환, 신경계 질환의 병력과 과거력이 없는 사람들을 대상으로 하였으며 정상대조군은 총 217명으로 남자가 105명(48.4%), 여자가 112명(51.6%)으로 평균 연령은 41.8±11.5세였다.

2. 연구방법

1) DNA 분리
   환자군과 정상대조군으로부터 정맥혈 2ml를 채취하여 EDTA가 함유된 tube에 넣어 처리한 뒤 24시간 이내에 DNA 추출이 불가능한 경우에는 -20℃에 냉동 보관 하였다. DNA 추출은 DNA Isolation Kit(Roche, Mannheim, Germany)를 이용하였다. 2ml의 혈액에 적혈구 융해 완충액 6ml를 가하고 잘 섞은 후 10분간 원심 분리하였다. 상층액을 새로운 tube로 옮긴 후 isopropranolol 650ul를 넣고 침전물이 생길 때까지 잘 섞은 후 10분간 놓아두었다. 그 후 1.5ml tube로 옮긴 후 단백질 침전 용액 468ul를 넣고 잘 섞은 후 10분 동안 원심분리 하였다. 상층액을 버리고 70% ethanol 900ul로 DNA를 세척한 후 10분 동안 원심분리 하였다. 상층액을 버리고 말린 후 TE완충액 200ul에 녹여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 PCR)에 사용하기 전까지 -20℃에서 보관하였다.

2) DNA의 중합효소 연쇄반응(PCR)
   본 연구를 위한 Apo-1/Fas promotor 유전자의 시발체(primer)는 Huang 등¹³⁾에 의하여 제시된 방법으로 합성하여 사용하였다. 시발체의 염기서열은 다음과 같다.

   Sense 시발체：5'-CTACCTAAGAGCTATCTACCGTTC-3'
   Antisense 시발체：5'-GGCTGTCCATGTTGTGGCTGC-3'

   DNA 증폭을 위한 PCR은 추출된 100ng/ul의 DNA 1ul에 2.5mM dNTP 1ul, 10pmol primer 각 1ul, Taq polymerase(Neurotics, Daejeon, Korea) 0.2ul(1 unit), 10배 PCR 완충용액 3ul, 3차 증류수 23.3ul를 첨가하여 총부피 30ul인 용액으로 만든 후 수행하였다. Master cycler gradient(Ependorf, Hamburg, Germany)를 이용해서 반응은 94℃에서 5분을 유지한 후, denaturation은 95℃에서 30초, annealing은 58℃에서 60초, extension은 72℃에서 60초로 40주기를 반복 수행하였고 마지막으로 extension을 극대화하기 위해 72℃에서 7분을 유지하였다.
   PCR로 증폭된 DNA 산물(332bp)을 ethidium bromide가 포함된 1.5% agarose gel에서 전기영동 시킨 후 UV transilluminator 위에서 밴드로 확인하였다.

3) 유전자형의 판별
   PCR로 증폭된 DNA 산물 7ul에 제한효소 MvaI(Roche, Indianapolis, IN) 0.15ul, 효소완충용액 2ul, 3차 증류수 10.85ul를 첨가하여 총 부피 20ul인 용액을 만들어 시행하였고 37℃에서 14시간 동안 처리한 후 ethidium bromide가 포함된 3% agarose gel에서 100V로 전기 영동하여 UV transilluminator 위에서 유전자형을 판별하였다(그림 1). -670부위에서 A→G로 치환유무에 따라 3가지의 유전자형으로 구분될 수 있는데, 제한 효소 MvaI으로 절단되지 않는 경우의 233/99bp 이중밴드(A/A homozygote), 절단되는 경우의 188/99/45bp 삼중밴드(G/G homozygote), 그리고 233/188/99/45bp 모두 나타나는 사중밴드(G/A heterozygote)로 확인되었다.

3. 통계 분석
   양극성 장애 환자군과 정상 대조군 사이의 Fas/Apo-1 promoter 유전자형과 대립유전자의 발현빈도에 대한 비교와 유의성 검증을 위하여 통계 프로그램 Statistic Analysis System(SAS)을 사용하여 χ²-test를 시행하였고, 유의수준은 p<0.05로 하였다.

결     과

1. Apo-1/Fas 유전자의 유전자형과 대립유전자 발현율 및 빈도
   양극성 장애 환자군과 대조군의 Fas/Apo-1 promoter 유전자형빈도(genotype frequency)와 대립유전자 빈도(allele frequency)를 표 1에 제시하였다.
   양극성 환자군의 MvaI RFLP 결과 유전자형은 A/A형 31(38.3%), G/G형 16(19.7%), G/A형 34(42.0%)였고, 대립유전자의 빈도는 A형 96(59.26%), G형 66(40.74%)이었다. 정상 대조군의 MvaI RFLP 결과 유전자형은 A/A형 36(16.6%), G/G형 71(32.7%), G/A형 110(50.7%)이었고, 대립유전자의 빈도는 A형 182(44.25%), G형 252(55.75%)이었다.

2. 양극성 장애 환자군과 대조군 사이의 유전자형과 대립유전자의 발현율 및 빈도의 비교
   양극성 장애 환자군과 정상 대조군 사이에 유전자형의 발현율(χ²=16.66, df=2, p=0.0002)과 대립유전자의 빈도(χ²=14.2254, df=1, p=0.0002)에서 유의한 차이가 있었다. 대립유전자간의 odd ratio를 분석한 결과 G 대립 유전자에 대한 A 대립 유전자의 odd ratio가 양극성 장애 환자에게 있어 약 2배 정도 높았다(OR=2.014 [1.395-2.906]).

고     찰

   본 연구에서 양극성 장애 환자군과 정상 대조군 사이에 Apo-1/Fas(CD95)유전자 다형성의 유전자형과 대립유전자의 빈도에서 유의한 차이가 있었다. 이러한 결과는 Apo-1/Fas promoter 유전자 다형성이 양극성 장애의 병인과 관련성이 있을 가능성을 제시한다.
   Apo-1/Fas 유전자와 신경정신과 질병에 관한 이전의 연구결과를 살펴보면, 알츠하이머 병(Alzheimer's disease)과 다운 증후군(Down syndrome)에서 신경세포와 신경교세포의 세포사멸에 Apo-1/Fas 유전자가 관련되어 있음을 보여준다.¹⁴⁾¹⁵⁾ 이는 세포사멸이 신경정신과적 질병의 병인에 관여한다는 본 연구의 가설과 일치하는 소견으로 정신과 질병이 신경세포발달 이상과 연관이 되어있음을 시사한다.
   그러나 양극성 장애에서의 세포 병인은 전통적인 신경퇴행성질환(neurodegenerative disease)과 차이를 보이며, 오히려 신경가소성(neuro-plasticity)의 손상과 연관이 되어 있는 듯 하다.¹⁶⁾¹⁷⁾ 예를 들어, 양극성 장애에서는 신경세포와 신경교세포의 감소가 관찰되나,¹⁸⁾¹⁹⁾ 헌팅톤 병(Huntington's disease)에서 보이는 신경퇴행(neurodegeneration)과 관련된 gliosis 소견은 보이지 않는다.²⁰⁾ 따라서 양극성 장애 환자의 뇌에서 관찰되는 세포소실(cell loss)과 위축(atrophy)은 신경보호(neuroprotective/neurotrophic) 작용의 감소와 세포사멸의 기능 이상과 같은 신경발달과 관련이 있을 것으로 생각된다. 최근, 양극성 장애의 치료에 사용되는 약물인 lithium이 신경보호 단백질 중의 하나인 Bcl-2를 증가시킨다는 보고가 이를 뒷받침한다.²¹⁾²²⁾
   한편, Apo-1/Fas(CD95)는 tumor necrosis factor (TNF) 수용체 군에 속하며 세포사멸 신호의 전달 외에 다양한 세포기능 즉, 세포의 증식, 분화, 유전자 발현, 면역계 조절기전에 관여하는 것으로 알려져 있다.²³⁾ 따라서 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루프스 등과 같은 면역계 질환과 Apo-1/Fas 유전자의 연합에 관한 여러 연구가 있어 왔다.¹³⁾²⁴⁾ 비록 이들 연구에서 통계적으로 의미 있는 결과를 얻지는 못하였지만, 이는 양극성 정동장애의 병인에 면역계가 관련될 수 있다는 가능성을 제시한다고 볼 수 있다.
   이전의 연구들은 양극성 정동장애에서 세포 매개성 면역(cell-mediated immunity)이 활성화 되어있다는 결과를 비롯해 면역계와의 관련성을 보고하였는데,²⁵⁾ 본 연구도 이를 일부 뒷받침할 수 있을 것으로 생각된다.
   결론적으로, 양극성 정동장애의 원인과 발생기전으로 여러 가설이 제기되었고 이에 따른 연구들이 진행되어 왔으나 지금까지 관련성이 명확하게 밝혀진 것은 없는 상태이다. 본 연구는 세포사멸로 설명되어지는 신경세포 발달이상과 이 질환의 관련성을 시사한다. 향후 정확한 관련성을 알아보기 위해 보다 많은 대상자, 특히 환자군을 확보한 연구가 필요하며 세포사멸과 관련된 다른 유전자의 다형성부위와 이 질병의 연합에 대한 연구도 있어야 할 것이다. 향후 연구에서는 양극성 장애의 발병 연령, 증상, 약물 치료에 대한 반응 유무, 기질적 특성 등과 같은 여러 임상 표현형으로 세분화하여 후보 유전자들과의 다형성 연합에 대한 연구가 수행될 것이다. 여러 제한점에도 불구하고 본 연구가 양극성 장애의 병인과 관련해서 유용한 분자 유전학적인 기초 자료가 될 수 있을 것으로 생각한다.

결     론

   양극성 장애 환자 81명과 정상 대조군 217명을 대상으로 중합효소 연쇄반응을 이용하여 Apo-1/Fas promoter 부위를 증폭한 후 MvaI 제한효소 절편 길이 다형성(restriction fragment length polymorphism, RFLP)을 비교 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
   MvaI RFLP 결과 양극성 장애 환자군과 정상 대조군 사이에 유전자형의 발현율(χ²=16.656, df=2, p=0.0002)과 대립유전자의 빈도(χ²=14.225, df=1, p=0.0002)에서 유의한 차이가 있었다.
   본 연구결과는 Apo-1/Fas promoter 유전자 다형성이 양극성 장애의 병인과 관련성이 있을 가능성을 시사하는 것으로서, 양극성 장애의 병인과 관련해서 유용한 분자 유전학적인 기초 자료가 될 수 있을 것으로 생각한다.