Korean Journal of Biological Psychiatry

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서     론

   산화 질소(Nitric oxide, 이하 NO)는 3가지 isoform (내피[eNOS], 유발가능[iNOS], 신경세포[nNOS])의 산화 질소 합성효소(nitric oxide synthase, 이하 NOS)에 의해 생성되며 체내에서 혈류 조절, 신체 방어, 신경 신호 전달 등의 작용에 관여하는 핵심 신호전달물질이다.¹⁾ 즉, NO는 acetylcholine과 bradykinin에 대한 반응으로 혈관 내피 세포에서 분비되어 혈관 평활근을 이완시켜 혈관 확장을 일으키는 Endothelial-derived relaxing substance(EDRF)로 작용하며,²⁾ 모든 포유류 유핵 세포에서 면역학적 자극에 따라 생성된 많은 양의 NO는 암 세포나 세포 내외의 미생물에 대해 주요 방어 기제로 작용한다.³⁾ 이러한 NO는 과량에서 혈관성 쇽, 뇌졸중, 당뇨, 신경 퇴화, 관절염, 만성 염증 등의 병태생리학적인 기전에 기여를 한다고 알려져 있다.
   NO는 뇌에서 신경 형태 형성을 조절하는 기능, 시냅스의 유연성을 조절하는 기능, 신경전달물질 분비를 조절하는 기능, 성적 행동과 공격적 행동을 조절하는 기능이 있고, 학습 및 기억과 관련된 장기 상승작용(long-term potentiation, LTP)에도 중요한 역할을 하며,⁴⁾ noradrenaline, dopamine, glutamate의 분비와 재흡수를 조절하는 역할과 NMDA 수용체 자극 이후 역행 신경세포 전령의 역할을 하는 기능⁵⁾이 있다는 것도 밝혀졌다. NO는 알코올과도 깊은 관련이 있어서 Baraona 등⁶⁾은 알코올에 노출되지 않았던 쥐에게 급성으로 알코올을 투여하면 혈장내 NO가 63%까지 증가된다고 하였고, Fitzgerald 등⁷⁾은 만성적인 알코올 섭취가 쥐의 전두-두정엽 피질, 해마, 줄무늬체에서 nNOS의 감소를 일으키고 측 중격핵에서는 증가를 일으킨다고 하였다. 임상적으로도 간경화 환자는 NO 생성이 증가되어 있으며,⁸⁾ 알코올성 간질환이 있는 환자의 혈청 질산염(nitrate)의 농도가 정상 대조군보다 높고, 아질산염(nitrite)의 농도는 문맥 고혈압 및 복수의 존재와 관련이 있다.⁹⁾¹⁰⁾ 반면에 Persson과 Gustafsson¹¹⁾은 오히려 알코올이 NO 생성을 억제한다는 보고를 하기도 했으며, Neiman 등¹²⁾은 제독된 알코올 의존 환자군의 뇌척수액에서 질산염과 아질산염의 농도가 정상 대조군에서의 결과와 차이가 없다고 보고한 바 있고, 다른 연구에서는 제독된 알코올 의존 환자의 말초 혈액에서 아질산염 농도가 알코올 의존 환자군의 말초 혈액에 비해 증가되지 않았다는 결과를 보였다.¹³⁾
   NO를 생성하는 NOS의 활동성도 알코올 중독과 깊은 관련이 있는데, 동물실험 결과 NOS 억제제는 과활동, 진전, 경직 등으로 나타나는 알코올 금단 증상을 감소시키고 NO 제공자(donor)를 금단 기간 중에 사용할 경우 금단 증상이 더 악화되는 것으로 확인됐다.¹⁴⁾ 또한, NOS의 억제가 알코올로 인해 나타나는 협동운동부전(motor incoordination)에 대한 급속 내성을 막기도 하고,¹⁵⁾ 알코올에 의한 마취를 NOS 억제제가 강화하고 NO 제공자가 저해한다는 보고¹⁶⁾도 있다. NO는 반응성이 크고 매우 불안정한 자유기이므로 NO 자체의 농도를 측정할 수는 없고, 혈액 내에서 혈색소와 반응하여 형성한 질산염(nitrate)과 아질산염(nitrite)의 농도가 NO의 농도를 반영한다.¹⁷⁾ 따라서, 본 연구에서는 NO가 알코올의 금단 증상의 정도에 영향을 미친다는 여러 연구 결과¹³⁾¹⁴⁾와, 아질산염 농도가 알코올 금단 기간에 반비례한다는 연구 결과¹³⁾를 바탕으로 음주력이 아질산염 농도와 관계가 있을 것이라는 가설을 세우고 이를 확인하고자 하였다.

연구대상 및 방법 

1. 연구대상 

1) 알코올 의존 환자군 
   2001년 1월부터 2002년 5월까지 한림대학교 한강성심병원 신경정신과 폐쇄 병동에 입원한 18~65세 사이의 남자 환자 중 DSM-IV의 알코올 의존 진단 기준¹⁸⁾을 충족시키는 환자를 대상으로 입원 직후에 연구자가 직접 면담을 통하여 CAGE 설문¹⁹⁾과 Alcohol Use Disorders Identification Test(AUDIT) 설문²⁰⁾을 통해 알코올 의존 정도를 평가하고 Clinical Institute Withdrawal Assessment for Alcohol(CIWA-Ar) 설문²¹⁾을 시행하여 금단 증상의 정도를 객관화, 정량화하였다. 혈중 NO 활성도에 영향을 주는 약물을 복용하고 있거나 염증성 질환이 있는 경우, 빈혈 등 혈색소의 수준에 영향을 미치는 혈액학적 질환이 있는 경우, 알코올 이외의 다른 물질 의존 병력이 검사전 3개월 이내에 있는 경우, 검사전 6개월 이내에 만성 신체적 질병이나 주요 정신과적 질환이 있는 경우는 제외한 40명을 대상으로 하였다. 

2) 정상 대조군 
   대조군의 선정은 한림대학교 한강성심병원 건강검진센터에 신체검사를 받으러 온 18~65세 사이의 사람 중 신체적 질병이 없고 약물 복용을 하지 않으며 알코올 의존의 병력이 없으면서, 최근 3개월간 다른 물질의존병력이 없고, 검사전 6개월 이내에 주요 정신질환의 병력이 없는 남자를 대상으로 CAGE와 AUDIT를 실시하여 CAGE 점수 2점 미만이고 AUDIT 점수 10점 미만 4점 이상인 정상 음주자 23명과 CAGE 점수 2점 미만이고 AUDIT 점수 4점 미만인 비음주자 16명으로 구분하여 연구 대상으로 하였다. 

2. 생화학적 지표 및 혈중 아질산염의 측정 
   알코올 의존 환자는 입원 다음날 아침 공복 상태에서, 정상 대조군은 검사일 아침 공복 상태에서 상완 정맥혈을 5cc 채취한 후 1,500rpm에서 7분간 원심분리하여 혈청 2cc를 -80℃에 보관하였다가 아질산염 농도를 측정하였고, 혈청 Aspartate aminotransferase(AST), Alanine aminotransferase(ALT), Gamma glutamyltransferase(GGT) 농도는 Hitachi 736 자동분석기로, Complete blood count(CBC)는 Technicon H-2 혈구 자동분석기로 측정하였다.
   아질산염 농도는 Griess 반응²²⁾을 이용하여 혈장 내에서 측정하였으며 구체적인 방법은 다음과 같다. 
   1) 냉동 보관했던 혈청을 녹여서 그중 6μl를 취한 후 44μl의 증류수와 혼합한다. 
   2) 여기에 0.31M, pH 7.5의 인산염 완충액 20ul를 혼합한 후 0.86mM NADPH 10μl와 0.11mM FAD 10μl, 질산염 환원효소(1.0U/ml) 10μl를 차례로 혼합한 후 상온의 암실에서 1시간 동안 보온한다.
   3) 2)에 Griess 반응액 200μl을 혼합한 후 상온에서 10분간 더 보온한다.
   4) Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) 판독기로 540nm에서 농도를 측정한다. 

3. 자료 분석 
   알코올 의존 환자군과 정상 대조군 사이의 일반적인 특성과 알코올 관련 생화학적 지표 비교는 Student t-test를, 아질산염과 다른 지표들 사이의 연관성에 대해서는 Pearson 상관 분석을 실시하였다. 알코올 의존 환자군과 음주군, 비음주군의 비교는 ANOVA를 시행하였다. 유의성 검증은 유의 수준 0.05 미만으로 하였으며, 통계 분석은 SPSS(version 11.0)를 이용하였다. 

결     과

1. 연구 대상의 인구학적인 특성 
   알코올 의존 환자군은 40명, 정상 대조군 39명이었다. 두 군 사이에 연령 차이는 없었으며(p=0.660), 교육 연한에도 차이가 없었고(p=0.711), 처음 음주를 시작한 나이에도 차이가 없었다(p=0.324)(표 1).

2. 알코올 관련 지표 
   두 군 사이에 CAGE 점수와 AUDIT 점수는 유의하게 차이가 있었다(p<0.000)(표 2).

3. 생화학적 지표 비교 
   두 군 사이의 AST, ALT, GGT, Mean corpuscular volume(MCV), 아질산염의 검사 결과는 표 3과 같다. AST는 알코올 의존 환자군이 139.85±168.50(IU/l)으로 정상 대조군의 24.13±6.38(IU/l)보다 유의하게 높았으며(p=0.000), ALT도 알코올 의존 환자군이 59.63 ±55.20(IU/l)으로 정상 대조군의 29.87±14.98(IU/l) 보다 유의하게 높았다(p=0.002). 또한 GGT도 알코올 의존 환자군이 313.08±417.85(IU/l)로 정상 대조군의 23.79±12.04(IU/l)보다 유의하게 높았다(p=0.000). MCV도 알코올 의존 환자군이 98.11±8.54(IU/l)로 정상 대조군의 93.13±3.93(IU/l)보다 유의하게 높았다(p=0.001). 그러나, 아질산염 농도는 알코올 의존 환자군과 정상 대조군 사이에 유의한 차이가 없었다(p=0.464).

4. 혈청 아질산염과 다른 지표와의 상관관계 
   알코올 의존 환자군을 대상으로 한 혈청 아질산염과 나이, 금주 기간, 음주를 시작한 나이, CAGE, AUDIT, CIWA-Ar, AST, ALT, GGT 등 다른 변수들과 아질산염 농도 사이에서는 유의한 상관 관계를 보이지 않았다(표 4).

5. 각 군에서 혈청 아질산염 농도 
   대조군을 AUDIT 점수에 따라 음주자(AUDIT 점수가 4~9점), 비음주자(AUDIT 점수가 3점 이하)로 나누고 이를 알코올 의존 환자와 비교해 본 결과 비음주자들은 음주자 및 알코올 의존 환자들에 비해 유의하게 아질산염 농도가 낮은 것으로 나타났으며(p=0.003)(표 5), Bonferroni 사후 검증 결과에서도 비음주자들과 음주자는 아질산염 농도가 다른 것으로 나타났다(표 6).

고     찰

   NO에 대한 연구는 최근 가장 활발히 진행되는 분야중의 하나이다. 과거에 NOS 억제제 주입 후 효과를 비교한다거나 조직에서 이차 전달자를 측정하는 등의 방법들을 거쳐 현재는 가스 분광기/질량 분광 계측기를 사용하여 아질산염과 질산염을 측정함으로써 내인성 NO 생성을 측정하고²²⁾ 각 NOS에 특징적인 mRNA를 측정하는 수준까지 와 있고 현재 각 NOS에 대한 선택적 억제제가 연구 중이다.
   NO의 역할에 대해서는 많은 연구가 진행되었는데, 그 역할이 병적인 진행인지 아니면 그에 대한 신체의 보상 기전인지는 아직 확실치가 않다. Sanchez-Rodriguez 등²³⁾은 간경화 환자에서 lympho-mononuclear cell에 있는 iNOS가 활성화되어 증가된 NO가 혈역학적 장애를 가져온다고 하였고, Hunt 등²⁴⁾은 단핵 세포에서 나온 NO가 알코올성 간질환 환자에서 증가되어 있고 이것이 간 손상에 중요한 역할을 한다고 설명하였다. 반면에 Yagnik 등²⁵⁾은 간에서 NO 생성이 endotoxemia로 인한 간 손상시 산소 자유기로 인한 조직의 손상을 막아주고 간의 미세순환을 유지해 주는 역할을 하기도 해 NO 생성 억제제 사용시 간이식 환자들에서 간손상이 악화된다고 보고했고, 동물 실험에서는 알코올로 인한 NO 생성 억제가 세포 증식에 장애를 가져온다는 연구도 있었다.²⁶⁾
   이번 연구에서 알코올 의존 환자와 정상 대조군 사이에 아질산염 농도의 차이가 유의하지 않았으나 음주군에서는 비음주군에 비해 유의하게 높은 아질산염 농도를 보였다. 알코올 의존 환자와 정상 대조군 사이에서 차이를 보이지 않은 것은 정상 대조군에 포함된 음주군에서 아질산염 농도가 높기 때문이다. 이전 연구들^6)9)10)27)에서 알코올 의존 환자와 정상 대조군 사이에서 아질산염 농도의 차이를 보이지 않은 것도 같은 이유 때문이라고 생각된다. 
   한편 알코올 의존 환자들은 금단 상태에서 오히려 정상 음주군보다 유의하지 않으나 다소 낮은 아질산염 농도를 보였다. 또한 알코올 금단 증상의 정도와 아질산염 농도는 관계가 없는 것으로 나타났다. 알코올 의존 환자에서 음주군에 비해 낮은 아질산염 농도가 나온 이유는 급성기와 만성기에서의 알코올과 NO의 관계를 생각해 보면 설명할 수 있을 것이다. 알코올이 급성기에 NO를 증가시킨다는 연구들이 있는 반면에, 동물 실험에서 만성적인 알코올 주입시 쥐의 쿠퍼 세포에서 지질다당질(lipopolysaccharide)로 인해 유발되는 iNOS의 생성이 대조군보다 저하되고 이로 인한 NO 생성의 감소가 쿠퍼 세포의 포식 작용을 저하시켜 알코올로 인한 암 발생율을 증가시킬 것이라는 연구²⁸⁾도 있다. 또한 같은 양의 지질다당질로 자극할 때 급성으로 4주 정도 알코올로 처치하면 쿠퍼 세포의 활동성을 나타내는 세포내의 칼슘 농도나 TNF-α의 분비가 유의하게 증가하나 12주 정도로 만성적인 알코올 처치 상태가 되면 그 감수성이 떨어져 세포내 칼슘 농도나 TNF-α의 분비가 감소하게 된다는 보고²⁹⁾도 있다. 이렇게 감소하는 TNF-α는 IFN-γ를 통해 활성화된 NO 생성 경로를 실질적으로 작동하게 하는 역할을 하며 이에 가장 주된 역할을 하는 세포가 간의 쿠퍼 세포라고 생각된다.³⁰⁾ Durante 등³¹⁾은 평활 근육 세포에서 iNOS의 mRNA가 IL-1b에 의해 자극되는 실험을 하면서 25mM 정도의 낮은 알코올은 mRNA 생성을 증가시키는 반면에 650mM의 고농도에서는 mRNA 생성이 억제되는 것을 밝혀냈고 이로서 이전에 알코올이 적절하게 사용될 경우에는 심혈관계 질환의 발생을 억제하는 효과가 있으나 만성적인 알코올 남용은 심혈관계 질환을 증가시킨다는 다른 연구들을 설명해 냈다. 한편 Syapin³²⁾은 만성적인 알코올 처치는 대뇌 피질 세포에서 NMDA에 의해 자극된 NO 생성을 강화시키지만 신경아교 세포에서 cytokine으로 유도된 NO 생성을 보다 효과적으로 억제한다고 밝혔다.
   이렇듯 알코올의 만성적인 사용은 iNOS의 감소, NO를 활성화시키는 cytokine의 감소를 통해 NO 생성을 억제할 수 있다.³¹⁾ 또한 알코올은 항체 반응 세포와 내피 세포에서 iNOS를 감소시키고 eNOS를 증가시키는데,³³⁾ 증가된 eNOS에도 불구하고 NO의 농도는 감소된 것이 확인됐다.³⁴⁾ 이는 eNOS의 증가가 알코올로 인한 산화 스트레스를 극복하기 위한 생체의 요구로 생각되었다.
   위의 연구들을 종합하여 볼 때 NO는 음주를 하는 사람들에서 전반적으로 증가되어 있는 소견을 보이나 이것이 금단 증상의 정도와는 관계가 없는 것으로 보인다. 알코올 의존 환자의 금단 상태에서 음주군에 비해 NO 농도가 떨어져 있는 소견을 보이나, 이것이 알코올 의존 환자에서 산화 스트레스를 막기 위해 NO가 사용된 결과인지, 혹은 알코올 의존 환자의 면역학적인 변화 등의 신체 변화 때문인지는 향후 연구가 필요할 것으로 생각된다.

결     론

   NO는 알코올에 대한 내성, 선호도, 섭취 행동과 관련이 있으며 알코올로 인한 금단 증상과 뇌 손상에도 영향을 미치는 물질로 알려져 있다. 본 연구는 알코올 의존 환자와 정상 대조군 사이에서 NO의 안정적인 대사산물인 말초혈액 아질산염의 농도를 측정하여 비교하고 알코올 의존 환자군에서 아질산염 농도와 알코올 의존의 다른 생화학적 지표인 aspartate aminotransferase(AST), alanine aminotransferase(ALT), gamma-glutamyltransferase(GGT), mean corpuscular volume (MCV) 등과의 상관 관계와 CAGE, AUDIT, CIWA-Ar, 마지막 음주 후의 시간 등 알코올 관련 지표들과의 상관 관계를 알아보고자 연구를 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 
   1) 알코올 의존 환자와 정상 대조군에서 말초 혈액 아질산염 농도는 유의한 차이가 없었다. 
   2) 알코올 의존 환자에서 금단 증상의 정도와 말초 혈액의 아질산염 농도는 상관 관계가 없었다.
   3) 정상 음주군에서 말초 혈액의 아질산염은 비음주군에 비해 유의하게 높았다. 
   이상의 결과를 종합해 볼 때 아질산염이 알코올 의존의 생화학적 표지자로 사용되기는 어렵고 금단 증상의 정도를 반영하기도 어렵다고 하겠다. 하지만, 음주가 신체내의 NO를 증가시키고 이 작용은 신체의 상태에 따라서 그 정도가 다르게 나타날 수 있다고 할 수 있다.