Korean Journal of Biological Psychiatry

교신저자：이준석, 412-270 경기도 고양시 덕양구 화정동 697-24
교신저자：전화) (031) 810-6230, 전송) (031) 810-5109, E-mail) mdjslee@kwandong.ac.kr

서     론

   열충격 단백질(heat shock protein；이하 HSP)이라고 알려진 일군의 단백질이 스트레스에 반응하여 극적으로 증가하는 세포 현상이 거의 모든 생물체에서 보편적으로 관찰된다.¹⁾ HSP는 분자적 샤프롱(molecular chaperone)의 기능을 하는데, 즉 외부 스트레스에 의해 세포내 단백질이 변성되었을 때, 리보솜(ribosome)에서 새로운 단백질이 합성될 때, 그리고 세포내에서 단백질이 이동하면서 막을 통과하려고 펼쳐질 때 노출되는 소수성(hydrophobic) 부위에 HSP가 결합하여 단백질의 응집(aggregation)을 막고 본래의 입체형태(conformation)를 유지시키는 작용을 한다.²⁾³⁾⁴⁾ 또한 최근에는 HSP가 분자적 샤프롱 이외에도 glucocorticid 수용체(glucocorticoid receptor：이하 GR)와 상호작용,⁵⁾ 아포프토시스의 조절,⁶⁾ 그리고 immunophilin과 결합⁷⁾과 같은 다양한 기능을 가진 것으로 알려졌다.
   HSP의 일종인 70kDa HSP(HSP70)는 정상적인 세포에서 가장 풍부하게 발견되는 HSP로서 다른 HSP와 마찬가지로 스트레스를 받지 않은 상태에서는 분자적 샤프롱의 기능을 하다가 스트레스에 노출되면 다량의 HSP70이 새로 합성되어 세포의 항상성(homeostasis)을 유지시킨다.⁸⁾⁹⁾ 특히 HSP70은 GR에 결합하는 최초의 HSP로서 구조적으로 불안정한 상태의 GR을 활성화시키는데 필수적인 역할을 하며,⁵⁾¹⁰⁾ 더 나아가 주요 우울증¹¹⁾¹²⁾ 이나 항우울제¹³⁾¹⁴⁾와 관련성도 보고되었다. 
   한편 우울증 환자에서는 혈장, 소변, 뇌척수액에서 cortisol 농도가 증가되어 있으며,¹⁵⁾ adrenocorticotrophic hormone(ACTH)에 대한 cortisol 반응이 과대하게 나타나고, 뇌하수체(pituitary)와 부신샘(adrenal gland)이 비대해져 있다.^15)16)17) 이와 같은 시상하부-뇌하수체-부신(hypothalamic-pituitary-adrenal；이하 HPA) 축의 과활동성(hyperactivity)은 우울증 환자에서 관찰되는 가장 일관된 특성들 가운데 하나이다. 또한 고농도의 glucocorticoid에 장기간 노출되면 해마(hippocampus)의 추체 신경세포(pyramidal neuron)가 소실되며, 수상돌기(dendrite)가 위축되는 등 신경독성이 나타난다.^18)19)20)
현재 우울증의 치료에서는 monoamine의 재흡수를 억제하는 약물이 주로 사용되고 있다. 특히 venlafaxine은 serotonin과 norepinephrine의 재흡수를 함께 억제하는 새로운 계열(SNRI)의 항우울제로서 널리 사용되고 있다. 생체에서 venlafaxine의 일차적 작용은 두 가지 monoamine의 수송체(transporter)를 막음으로써 시냅스에서 serotonin과 norepinephrine의 농도를 높이는 것이다. Venlafaxine을 투여한 후 시냅스에서 monoamine의 농도가 높아지는 효과는 즉각적으로 나타나는 반면 항우울 효과는 2주 내지 6주가 지연되어 나타난다.²¹⁾ 이런 지연 효과는 monoamine의 재흡수를 억제하는 다른 항우울제에서도 마찬가지로 관찰되며, 이런 현상을 설명하기 위하여 최근에는 monoamine결핍 가설 이외에도 수용체-후 신호전달(post-receptor signaling)의 변화^22)23)24) 나 HSP70과 관련성¹³⁾¹⁴⁾ 등 항우울제의 다양한 기전들이 제시되고 있다. 
   이런 맥락에서 본 연구는 흰쥐 C6 glioma 세포를 이용하여 venlafaxine 처리 후 HSP70의 발현을 조사하였다. C6 glioma 세포는 adenylyl cyclase activity의 상승처럼 항우울제 투여 후 쥐의 뇌에서 일어나는 생체 변화와 유사한 방식으로 항우울제에 대한 반응을 나타내며 높은 수준의 GR을 가지고 있는 반면, serotonin과 norepinephrine 수송체(transporter)는 갖고 있지 않다.^25)26)27) 따라서 본 연구의 결과는 serotonin이나 norepinephrine 수용체(receptor) 혹은 각각의 수송체(transporter)와 같은 monoamine의 작용을 넘어서는 기전에 의한 것이라고 할 수 있다. 먼저 venlafaxine을 단독으로 1, 6, 24, 72시간 동안 처리했을 때 HSP70의 발현 정도를 면역탁본법(immunoblot)을 이용해 조사하였다. 다음으로 생체에서 우울증 상태와 유사하게 venlafaxine과 dexamethasone을 1, 6, 24, 72시간 동안 동시에 처리했을 때 HSP70의 발현 양상을 비교 조사하였다.

연구방법

1. 실험 재료
   본 실험에 사용한 흰쥐 C6 glioma 세포는 ATCC사(USA)로부터 구입하여 사용하였다. Dexamethasone은 Sigma사(St. Louis, MO)에서 구입하였고, HSP70에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology사(USA)에서 구입하였다. Venlafaxine은 한국와이어스사로부터 제공받아 사용하였다. 그 외 일반적인 화학약품은 대부분 Sigma사(USA)에서 구입하여 사용하였다.

2. 세포 배양 및 시약 처리
   흰쥐 C6 glioma 세포는 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 10% fetal bovine serum(FBS: Gibco BRL Co, Gaithersburg, MD)이 포함된 DMEM(Gibco BRL Co, Gaithersburg, MD) 배지에 배양하였다. 48시간 주기로 DMEM 배양액을 교체하며, 성장 안정기까지 배양하였다. Dexamethasone은 95% ethanol을 사용하여 2.55mM 농도로 녹인 후 -20℃에 저장하였다. 실험 직전 본 저장 용액 0.25 ml를 배양 접시(Nunc, Vangard, Neptune, NJ)에 넣어 ethanol을 증발시킨 뒤, 10ml DMEM 배지(Gibco BRL Co, Gaithersburg, MD)로 다시 녹여 실험에 이용하였다. Venlafaxine은 멸균된 물로 녹여 여과한 후 희석하여 사용하였다. 본 연구에서는 dexamethasone과 venlafaxine의 농도는 세포 배양 조건에서 HSP의 발현²⁸⁾이나 세포내 신호²⁹⁾³⁰⁾을 조사하였던 선행 연구를 참고하여 예비 실험을 시행한 결과 아포프토시스를 일으키지 않는 농도(dexamethasone 10uM과 venlafaxine 10uM)를 각각 선정하였다.

3. 단백질 분리
   100mm 접시에 준과밀도로 자란 세포들을 phosphate buffered saline(PBS)으로 씻은 후 2,000-3,000rpm으로 5분간 원심분리하여 세포들을 수확하였다. Pro-Prep^TM(iNtRON biotechnology, USA)을 약 5×10⁶ 세포에 400ul씩을 넣고 잘 섞은 후 얼음 속에서 20분간 세포들을 용해시켰다. 다시 4℃에서 13,000rpm으로 5분간 원심분리하여 얻은 상층액을 새로운 1.5ml 튜브에 옮겼다. 단백질 정량과 면역탁본(immunoblotting)을 하기 전까지 얻어진 단백질을 -20℃에 보관하였다.

4. 단백질 정량
세포로부터 얻은 단백질을 Bradford 방법으로 정량하였다. Bradford reagent(Bio-Rad)를 1：5의 비율로 증류수에 희석하여 준비하였다(working solution). Bovine serum albumin(BSA) standard를 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0mg/ml로 준비하였다. 96 well plate에 standard를 10ul씩 넣은 후 working solution을 200ul씩 첨가했다. 분리한 단백질을 10배 희석하여 10ul씩 96 well plate에 넣은 후 working solution을 200ul씩 첨가하였다. 준비된 standard와 정량하고자 하는 단백질을 5분간 상온에 방치하였다. ELISA reader를 이용하여 wave length 595nm에서 흡광도를 측정하였고, standard curve를 이용하여 단백질의 농도를 측정하였다.

5. Western blot analysis
   HSP70의 발현 양상을 살펴보기 위해 세포추출물에 대해 항HSP 단일클론항체(Anti-HSP70mAb)를 사용하여 면역탁본(immunoblotting)을 실시하였다. 동량의 단백질을 Laemmli sample 용액(62.5mM Tris-Cl, pH 6.8；2% SDS；10% glycerol；0.5% β-mercaptoethanol；10μg/ml bromophenol blue)에 넣고 5분간 끓인 후 10% polyacrylamide-gel에 얹고 SDS-PAGE를 시행한 다음 20% 메탄올 용액에서 gel내의 단백질을 100V로 4℃에서 nitrocellulose membrane으로 90분간 이송시켰다. Nitrocellulose membrane을 5% nonfat-dry milk가 포함된 TBS-T 완충액(20mM Tris-HCl, pH 7.6；500mM NaCl, 0.1% Tween 20)에 넣고 교반기에서 상온으로 1시간 방치하였다. Anti-HSP70mAb (200μg/ml)를 1：2,000배 희석하여 첨가한 TBS 완충액 속에서 1시간 반응시켰다. 교반기 위에서 TBS-T 완충액으로 nitrocellulose membrane을 다시 15분간 2회 씻은 후 HRP-conjugated anti-mouse IgG(1：1000 dilution)를 넣고 1시간 반응시켰다. 다시 nitrocellulose membrane을 TBS-T 완충액으로 15분간 2회 씻은 후, 1：40으로 섞은 ECL+ reagents에 반응시키고 필름으로 감광하였다. QuantityOne software(Bio-Rad)를 이용하여 HSP70의 농도를 정량하였다.

6. 통계학적 분석
   모든 실험값은 평균값±표준오차(mean±standard error)로 하였고, 통계학적 분석은 SPSS program을 이용하였다. 약물 처리에 따른 HSP70 발현 양상의 차이를 보기 위하여 분산분석(ANOVA)을 실시하였고, 각 집단간의 통계학적 유의성은 paired samples t-test를 이용하여 검정하였다.

결     과

1. Dexamethasone이 HSP70의 발현에 미치는 영향 
   먼저 dexamethasone이 단독으로 HSP70 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 배양용기에 흰쥐 C6 glioma세포들이 85% 정도의 성장을 보일 때 dexamethasone (10uM)이 포함된 새로운 배양액으로 교체하고 6시간 처리한 다음, 얻어진 단백질을 이용하여 western blotting을 5번 반복 실시하여 발현정도를 조사하였다. 대조군과 비교할 때 dexamethasone을 처리한 경우 HSP70의 발현은 차이가 없었다(표 1). 

2. Venlafaxine 단독 처리가 HSP70의 발현에 미치는 영향
   Venlafaxine을 C6 glioma cell에 단독으로 처리했을 때 HSP70 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 세포들이 85% 정도의 성장을 보였을 때 venlafaxine(10uM)이 포함된 새로운 배양액으로 교체하여 각각 1시간, 6시간, 24시간, 72시간 동안 처리한 다음 HSP70 발현을 조사하였다(그림 1). 항-HSP70 단일클론항체를 이용하여 HSP70의 발현 정도를 조사한 결과, 대조군과 비교하여 venlafaxine으로 처리한 이후 1시간(P=0.027)에 HSP70의 발현이 의미 있게 증가하였으며, 이후 시간의 경과에 따라 감소하여 24시간 이후에는 대조군 수준 이하로 감소되는 경향을 나타냈다(표 2). 

3. Venlafaxine과 dexamethasone의 동시 처리가 HSP70의 발현에 미치는 영향
   Venlafaxine과 dexamethasone을 C6 glioma cell에 함께 처리하였을 때 HSP70 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 세포들이 85% 정도의 성장을 보였을 때 venlafaxine(10uM)과 dexamethasone(10uM)이 포함된 새로운 배양액으로 교체하여 1시간, 6시간, 24시간, 72시간 동안 배양하여 HSP70 발현을 조사하였다(그림 2). 표 2에 나타낸 것처럼 대조군에 비하여 venlafaxine과 dexamethasone을 동시 처리한 이후 1시간에서는 HSP70의 발현이 증가되는 경향을 보였지만, 이후 급격히 감소하여 72시간(p=0.001)에서는 대조군에 비하여 의미 있게 감소되었다. 

고     찰

   세포에서 HSP는 분자적 샤프롱(molecular chaperone)의 기능을 하는데, 스트레스를 받지 않은 상태에서 HSP는 세포질과 핵내에 존재하는 heat shock transcription factor(HSF)라고 알려진 전사 인자(transcription factor)의 단량체(monomer)와 일대일 결합을 하여 HSP-HSF 복합체(complex)를 형성하고 있다. 세포에 스트레스가 가해져서 오중첩 단백질(misfolding protein)의 양이 증가하면 HSP는 이런 오중첩 단백질(misfolding protein)과 결합하면서 HSF로부터 떨어진다. HSP로부터 분리된 HSF는 삼합체(trimer)로 뭉쳐서 핵내로 이동하여 heat shock gene promotor에 위치한 heat shock element (HSE)와 결합하여 heat shock gene의 전사(transcription)를 활성화시킨다. 결과적으로 free HSP의 발현이 증가되면 HSF가 DNA로부터 떨어져서 단량체(monomer)로서 다시 HSP-HSF 복합체의 형성을 증가시키는 과정을 통하여 HSP 발현이 조절된다.³¹⁾ 특히 HSP70은 우울증의 병태생리와 밀접하게 연관되는데, HSP70 mRNA의 결손이 일부 우울증 환자에서 발견되지만 정상군이나 여타 질환을 가진 경우에서는 발견되지 않았으며,¹¹⁾ 또한 HSP70은 우울증과 밀접한 관련을 가진 GR의 기능을 조절한다.⁵⁾¹⁰⁾
   본 연구결과 venlafaxine을 C6 glioma 세포에 처리한 초기에는 HSP70의 발현이 증가하였다. 다만 venlafaxine을 단독으로 처리한 경우에는 1시간에서 HSP70의 발현이 의미 있게 증가하였던 반면, dexamethasone과 함께 처리한 경우에는 발현이 급격히 증가하는 경향을 보였으나 통계적 의미를 갖지는 못했다. 최근에 imipramine, amitriptyline, clomipramine, citalopram과 같은 삼환계 항우울제들이 여러 세포주에서 아포프토시스를 일으킨다고 보고되었고,^32)33)34) 선택적 serotonin 재흡수 억제제(selective serotonin reuptake inhibitor；이하 SSRI)의 하나인 fluoxetine이 C6 glioma 세포에서 아포프토시스를 일으킨다고 보고 되었다.³²⁾ 본 연구에서는 아포프토시스를 일으키지 않는 venlafaxine의 농도(10uM)를 선택하였으므로 세포의 아포프토시스까지는 일으키지 않았지만 1시간에서 HSP70의 발현이 증가된 것은 venlafaxine이 투여 초기에는 오히려 신경세포에 스트레스 인자로 작용할 가능성을 시사한다.
   Venlafaxine을 장기간 처리한 경우에는 HSP70의 발현이 감소되었는데, dexamethasone과 함께 처리한 경우에는 72시간에서 의미 있게 감소되었으며, venalafaxine 단독으로 처리한 경우에는 감소되는 경향만을 나타냈다. 이처럼 venlafaxine의 장기적 처리에 의하여 HSP70의 발현을 감소시킬 수 있는 몇 가지 기전이 있다. 첫 번째는 venlafaxine이 mitogen-activated protein kinase (MAPK)의 유도를 통하여 HSF의 활동도를 감소시키는 기전이다. MAPK는 HSF의 부적 조절인자라는 연구결과가 있었으며,³⁵⁾³⁶⁾ MAPK에 속하는 Extracellular signal-regulated kinases(ERKs)가 HSF를 비활성화시킨다고 보고 되었다.³⁷⁾ 또한 최근에 Khawaja 등³⁰⁾은 C6 glioma 세포에서 venlafaxine을 3일간 처리한 이후 MAPK 경로의 p90Rsk, pCREB, pELK-1 등을 증가시킨다고 보고하였다. 즉, venlafaxine에 의해 상승된 MAPK 경로를 통하여 HSF가 억제되어 HSP70의 발현이 감소될 수 있다. 두 번째로 venlafaxine에 의한 GR의 전위 기전이다. Fluoxetine, milnacipran, clogyline 등 다양한 종류의 항우울제가 GR의 전위를 일으키는 것으로 알려져 있다.³⁸⁾ 핵으로 전위된 GR은 HSF의 활동도를 억제시키며, 이와 함께 GR이 전위되는 과정에서 free HSP70이 상승되어 HSF의 삼합체화(trimerization) 과정을 억제시키는 부적 되먹임 과정을 통하여 HSP70의 수준이 감소될 수 있다. 따라서 venlafaxine이 GR을 핵내로 전위시키는 기전은 HSP70의 발현을 감소시킬 수 있다. 본 연구에서 Dexamethasone과 venlafaxine을 함께 처리한 경우에는 HSP70의 발현이 의미 있게 감소된 반면, dexamethasone이나 venlafaxine을 단독으로 처리했을 때는 HSP70의 발현에 의미 있는 변화가 없었다. 이런 결과는 venlafaxine이 GR을 전위시키는 기전을 통하여 HSP70의 발현을 감소시켰을 가능성을 시사한다.

결     론

   본 연구에서는 흰쥐 C6 glioma 세포를 이용하여 venlafaxine 처리 후 HSP70의 발현을 조사하였다. 먼저 venlafaxine을 단독으로 1, 6, 24, 72시간 동안 처리했을 때 HSP70의 발현 정도를 면역탁본법(immunoblot)을 이용해 조사하였다. 다음으로 생체에서 우울증 상태와 유사하게 venlafaxine과 dexamethasone을 1, 6, 24, 72시간 동안 동시에 처리했을 때 HSP70의 발현 양상을 비교 조사하였다. 
   본 연구결과 첫째로venlafaxine을 C6 glioma 세포에 처리한 초기에는 HSP70의 발현이 증가하였다. 다만 venlafaxine을 단독으로 처리한 경우에는 1시간에서 HSP70의 발현이 의미 있게 증가하였던 반면, dexamethasone과 함께 처리한 경우에는 발현이 급격히 증가하는 경향을 보였으나 통계적 의미는 갖지 못했다. 둘째로 Venlafaxine을 장기간 처리한 경우에는 HSP70의 발현이 감소되었는데, dexamethasone과 함께 처리한 경우에는 72시간에서 의미 있게 감소되었으며, venalafaxine 단독으로 처리한 경우에는 감소되는 경향만을 나타냈다. 
   본 연구는 venlafaxine이 단기적으로는 신경세포에 스트레스 인자로 작용하여 HSP70의 발현을 증가시키는 반면, 장기적으로는 HSP70의 발현을 감소시킨다는 새로운 기전을 제시한다.