Korean Journal of Biological Psychiatry

교신저자：오동열, 412-270 경기도 고양시 덕양구 화정동 697-24
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서     론

   알코올 남용은 내성(tolerance), 의존(dependence), 강화(reinforcement), 감작화(sensitization), 갈망(craving)과 같은 다양한 부정적 결과를 초래하고¹⁾ 장기적으로 여러 장기에 독성을 일으켜 병의 이환(morbidity)과 사망(mortality)으로 이끌기도 한다. 이러한 에탄올의 작용을 세포 수준에서 이해하고 알코올 중독 환자를 치료하기 위해서는 알코올에 반응하는 유전자 혹은 반응 경로를 알아내는 것이 필요하다.²⁾ 
   에탄올에 의한 유전자 표현에서 가장 많이 연구 된 것은 글루타메이트(glutamate)나 가바(γ-aminobutyric acid, GABA)이다. 이러한 수용체는 에탄올에 노출된 급성기의 중독(intoxication) 효과 뿐 아니라^3)4)5)6) 만성적으로 노출되었을 때 내성과 의존의 발생에 관여하는 것으로 알려져 있다.^7)8)9)10) 그밖에도 여러 알코올 반응 유전자가 발현차(differential display), northern blotting 그리고 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive polymerase chain re-action)을 이용한 연구에서 발견되어 왔으나, 알코올 의존과 같은 복합적 현상에는 여러 가지 유전자가 관여하므로 한 개의 후보 유전자를 연구하는 고전적 연구 방법으로는 에탄올의 작용을 완전히 이해하기 어렵다. 최근에는 DNA array의 발달로 동시에 수천 수만개의 유전자의 표현을 검사하는 것이 가능하게 되었다.¹¹⁾
   cDNA Microarray는 Northern blot의 역실험(Reverse Norther)이라고 할 수 있다. 즉, 특정 유전자 probe을 먼저 고정시키고 조직에서 얻은 mRNA를 가하여 발현 양상을 조사하는 것과 같다. 이러한 방법은 신뢰도 문제와 절대적 수치가 아닌 상대적 비교치만 볼 수 있다는 극복해야할 한계점을 가지고 있지만, Northern blot과 달리 수많은 유전자 probe를 동시에 사용할 수 있는 장점을 가진 획기적 유전자 발현 시스템으로서 정신질환을 비롯한 다요인성 질환에서 개인의 특정 질환에 대한 취약성, 병의 진단과 예후, 약물 치료의 표적, 특정 약물에 대한 개인 간 효능과 독성의 차이 등 다양한 분야에서 응용이 가능하다.¹²⁾
   그 동안 oligo-DNA arrays를 이용한 알코올 관련 연구에서는 사람의 SH-SY5Y 신경모세포종(neuroblastoma) 세포에 있어서 알코올에 의해 유도된 유전자 표현의 변화가 연구된 바 있다.¹³⁾ 또, 알코올 선호 흰쥐(iP)와 비선호 흰쥐(iNP)의 해마에 있어 유전자의 차이가 연구되었고,¹⁴⁾ 알코올 의존인 사람의 뇌 부검 조직에서 기능적으로 관련된 유전자들이 microarrays를 사용하여 발견되었다.¹⁾¹⁵⁾ 
   본 연구에서는 알코올을 흰쥐의 신경아교종(glioma) 세포에 처리했을 때 급성기에 어떤 유전자의 발현을 조절하는지 DNA microarray를 이용하여 알아보고자 한다.

방     법

1. 세포 배양 및 에탄올 처리
   흰쥐 신경아교종 C6 세포주는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에 10% fetal bovine serum(10% FBS)과 100IU/I penicillin, 10μg/ml stereptomycin을 첨가하여 습기를 보유한 37℃, 5% CO₂의 배양기에서 배양하였다. 세포는 2×10⁶ cell/10-mm plate로 되도록 polystyrene 세포 배양 접시에 분주하였으며, 24시간 동안 세포를 부착시켰다. 배지를 갈아주고 대조군은 증류수 10μl(8 plates), 실험군은 10% 에탄올(최종 농도 1%, 8 plates)을 처리하여 36시간 배양하였다.

2. 총 RNA 분리
   총 RNA 분리는 Chomczynski와 Sacchi(1987)에 의해 개발된 single-step RNA 분리 방법(isolation method)를 개선한 TRIZOL(Invitrogen, Carlsbad, CA) 방법으로 수행하였다. 에탄올을 처리하고 36시간이 지난 후에 배지를 제거하고, 차가운 인산염 식염수(phosphate buffered saline)(PBS, pH 7.4)로 2회 세척한 후 1ml의 TRIZOL을 넣어 세포를 파쇄한다. 세포를 파쇄한 시료를 새로운 튜브에 옮긴 후 1ml의 클로로포름(Sigma, USA)를 첨가하여 단백질을 변성 시키고 15,000rpm 15분, 4℃에서 원심분리하여 상층액을 회수하여 새로운 튜브에 옮겼다. 동량의 isopropyl alcohol(Sigma, USA)을 넣어 얼음에서 1시간 동안 방치하였다. 방치 후 15,000rpm, 15분, 4℃에서 원심분리하고 상층액을 제거한 후 75% 에탄올 1ml를 넣어서 잘 섞어 14,000rpm, 15분, 4℃에서 원심분리하였다. 상층액을 첨가하여 다시 원심분리하여 상층액을 모두 제거하였다. 튜브 아래의 응집체를 15분 동안 상온에서 건조시키고 DEPC(Amresco, Inc, USA) 처리된 3차 증류수 30μl를 첨가하여 녹였다. 분광편광계(Spectrophotometer VU 1601, Shimazu, Japan)를 이용하여 파장 260nm와 280nm로 흡광도를 측정하여 A260/A280의 값이 1.7 이상인지를 확인하였다.

3. cDNA microarray 
   유전자 발현 양상을 조사하기 위해 TwinChip^TM Rat-5K(Digital Genomics Inc, Korea)를 이용하여 cDNA microarray를 수행하였다. PCR 튜브에 대조군 총 RNA와 실험군 총 RNA로 각각 annealing 반응 혼합물을 준비한 후, 70℃, 5분간 방치하고 튜브를 얼음으로 옮겼다. 새 튜브에 실험군과 대조군 각각의 반응액 [5×AMV RT buffer, low dT dNTP, 1mM Cy3(대조군), Cy5(실험군)-dUTP, Rnase inhibitor, AMV reverse transcriptase]를 준비하여, annealing 반응 혼합물에 각각 첨가하고 42℃에서 1시간동안 방치하였다. 0.5M EDTA 5μl를 넣어 반응을 중단시켰다. 각 튜브에 1N NaOH 10μl를 첨가하여 37℃에서 10분간 방치한 후 1M Tris HCl 완충액을 25μl를 첨가하였다. 완충용액이 제거된 chromaspin column에 준비된 반응액을 넣고, 1,300rpm, 3분 동안 원심분리였다. 각각의 시료에 100% 알코올 300μl와 3M sodium acetate 10μl를 첨가하고 -70℃에서 30분간 방치한 후 12,000rpm, 15분, 4℃에서 원심분리하여 상층액을 완전히 제거하였다.
   침전물을 건조한 후 20μl hybridization 완충액(25% formaldehyde, 5×SSC, 0.1%SDS)에 녹여 95℃에서 시료를 5분간 끓인 후, pre-hybridization된 cDNA microarray의 표면에 부하한 후 커버 글라스를 덮고, hybridization chamber에 옮겨 58℃에서 16시간 동안 방치하였다. 58℃ 제 1 세척완충액(2×SSC, 0.1%SDS)에 슬라이드를 넣어 커버글라스를 제거하고, microarray를 세척완충액에 넣고 42℃에서 5분간 방치하였다. 제 2 세척완충액(0.1×SSC, 0.1%SDS)에 microarray를 넣고 실온에서 1분간 방치하고, 이 과정을 4회 반복한다. 그 후 650 rpm, 5분간 원심분리하여 건조시켰다. Microarray scanning은 Packard 사의 Scanarrayseries Quantarray를 이용한 confocal laser scanning을 통하여 이미지를 얻은 후 GenePix 프로그램을 이용하여 각 유전자의 형광 강도 정량 및 유전자 발현 양상을 분석하고 표준화(normalization)을 수행하였다.
   이 연구에서는 Digital Genomics에서 제공한 Twin-Chip^TM Rat-5K을 이용하여 실험하였고, 2회의 반복 실험으로 4회와 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 각 유전자 발현 자료는 에탄올을 처리한 군은 Cy5 염색약에 의한 붉은 색 신호로, 대조군은 Cy3 염색약에 의한 녹색 신호로 표시하여 두 이미지를 겹쳐서 표시하였다.
   MA plot은 신호강도(signal intensity)와 Cy5/Cy3의 분포를 보여주는 산점도이다(그림 1). 가로축은 A, 세로축은 M 값을 나타내며, 일반적으로 A 값(신호강도)이 큰 경우에 그 자료가 더 정확한 값으로 생각할 수 있다. 신호강도가 클 경우 기술적 변이에 의한 자료의 변화가 상대적으로 적게 반영되기 때문이다. A와 M 값은 다음과 같은 식으로 계산된다.

   M=log2(CY5/CY3)
   A=[log2(Cy5XCy3)]/2(Signal intensity)

   이 연구에서 발현의 차이를 보이는 유전자 선정은 ±1.6배(M=±0.8)로 정하였다.

결     과

   흰쥐의 신경아교종 C6 세포주에 에탄올을 처리한 군과 대조군간의 유전자 발현의 차이를 cDNA microarray를 사용하여 실험 후 비교 분석한 결과 에탄올이 처리된 군에서 대조군에 비해 15개의 유전자가 발현이 증가하였고, 12개의 유전자가 발현이 감소하였다.

1. 발현이 증가한 유전자
   발현이 증가한 유전자에는 1) GATA-bindning protein 2, 2) adenosine A2a receptor(전사의 조절, DNA-dependent；A2A 아데노신 수용체 활성도, G-protein coupled), 3) procollagen, type Ⅱ, alpha 1(세포접합；세포외기질 구조 구성성분), 4) Orthodenticle(Drosophila) homolog 1(전사의 조절, DNA-dependent, 발달；전사 인자 활동)가 포함되어 있었다(표 1).

2. 발현이 감소한 유전자 
   발현이 감소한 유전자에는 1) diacylglycerol kinase beta, 90kDa(protein kinase C 활성화, 세포안에서의 신호전달 cascade：diacylglycerol kinase 활동), 2) PRKC, apoptosis, WT1, regulator, 3) Protein phosphatase 1, catalytic subunit, gamma isoform 1, 4) clathrin-associated protein 17, 5) nucleoporin p58, 6) proteasome(prosome, macropain) subunit, alpha type 4(ubiquitin-의존 단백질 이화작용；proteasome endopeptidase 활동)가 포함되어 있었다(표 2).

고     찰

   이 연구에서는 DNA 칩을 이용하여 에탄올을 흰쥐의 신경아교종 세포주에 처리했을 때 단기간에 일어난 유전자 발현의 변화를 알아보았다. 그 결과 17개의 유전자가 발현이 증가하였고, 15개의 유전자가 발현이 감소하였다.
   Adenosine A2a receptor 유전자의 발현이 증가하였는데, 이 유전자는 전사(transcription)의 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다. Nagy 등¹⁶⁾에 의하면 에탄올에 노출된 급성기에 뇌세포는, adenosine 유입을 억제함으로써, 세포외 adenosine을 증가시켜 adenosine A2 수용체를 활성화시키고 세포내 cAMP 수준을 증가시킨다고 한다. 그리고 이 반응은 adenosine 수용체의 길항제에 의해 억제 되는 것이 증명되었다.¹⁷⁾ 이후 Asher 등¹⁸⁾은 에탄올은 CREB(cAMP response element-binding protein)과 PKA(protein kinase A)에 의해 조절되는 cAMP-dependent gene expression을 유도하고, 이러한 신호 경로가 알코올리즘에서 보이는 중독(addictive) 행동을 매개할 것이라고 제시하였다. 특히, Yao 등¹⁹⁾은, nucleus accumbens(NAc) 부위는 한 세포에 A2와 D2 수용체가 둘 다 발현되므로 에탄올에 노출되면 상승 효과를 낸다고 하였다. 그리하여 비록 역치하의 에탄올에 노출되어도 cAMP/PKA 신호전달경로를 활성하므로, NAc는 에탄올에 과민한 특성을 갖게 되며, 이 신호경로가 알코올리즘과 알코올 남용을 예방하고 치료하는 약물의 분자 수준의 표적(target)이 되어야 한다고 주장한 바 있다.
   Proteasome(prosome, macropain) subunit, alpha type 4 유전자의 발현이 감소하였는데, 이 유전자는 ubiquitin-dependent protein catabolism과정에 관여하며, proteasome endopeptidase activity의 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 이는 Gutala 등²⁰⁾이 쥐의 뇌 피질에 에탄올을 장기적으로 투여한 결과 ubiquitin-proteasome 경로에 관여하는 유전자의 발현이 감소하였다고 보고한 것과 일치한다. proteasome은 polyubiquitinated protein을 분해하는데 관여하는 multicatalytic complex이다. 그 뿐 아니라 ubiquintin-proteasome 의존 체계는 시냅스의 성장과 여러 가지 후시냅스 단백질을 조절하여 뇌 기능의 변화에 직접적으로 관련되는 것으로 알려져 있다. proteasome이 억제되면 산화된 단백질이 뭉쳐져 단백질 조절에 장애가 유발되면 신경세포의 퇴행을 일으키고 결국 세포를 사망으로 이끈다고 한다. 이 결과는 Sokolov 등²¹⁾이 발표한 알코올 중독자의 사후 뇌 실험 결과와도 일치한다.
   PRKC, apoptosis, WT1, regulator 유전자의 발현이 감소하였는데, Par-4(prostate apoptosis response-4)는 leucine zipper protein 으로서 pro-apoptotic 기능을 가지고 있으며, 알츠하이머성 치매에 있어서 신경세포의 퇴행과 연관되어 있다.²¹⁾
   또, Orthodenticle(Drosophila) homolog 1 유전자의 발현이 증가되었는데, homeobox-containing gene의 기능이 상실되면 뇌의 발달에 영향을 주고 간질 발작이 유발되는 것을 그려져 있다.²³⁾ 그리고 이 유전자는 혈액 세포의 생성에도 관여한다고 한다.²³⁾
   종합하여 보면 흰쥐의 신경아교종 세포주에 알코올을 처치하였을 때 급성기에 알코올에 반응하여 발현이 증가하거나 감소한 유전자는 전반적으로 전사의 조절, 신호전달체계, 허혈성 뇌손상의 중재, 신경세포의 퇴행에 관여하는 것들이었다. 이 연구에서는 유전자 발현 시스템을 이용하여 에탄올에 반응하는 가능성 있는 새로운 유전자들을 관찰할 수 있었다.
   그러나, 이 연구의 제한점으로, cDNA chip은 선별 도구(screening tool)로서 상당히 많은 false-positive를 가지고 있으므로, Northern blot이나 realtime RT-PCR 등으로 확인하여야 함에도 불구하고 그 과정이 없다는 것을 들 수 있다. 이에 대해서는 추가 실험이 필요할 것이다.
   향후, 알코올에 대한 감수성의 차이, 알코올 처리 기간의 차이, 다른 부위의 조직, 알코올의 여러 농도에 따른 반복적 실험과 기능 분석을 하는 연구가 필요할 것으로 사료된다. 그럼으로써, 알코올의존에 내재된 분자생물학적 기전을 이해하고, 알코올리즘의 치료 약물의 새로운 표적을 알아내는 것이 필요할 것이다.

요     약

연구목적：
   알코올의존에 내재된 분자생물학적 기전을 이해하고 알코올리즘 치료 약물의 새로운 표적을 알아내기 위해서는, 알코올에 반응하는 유전자 혹은 반응 경로를 알아내는 것이 필요하다. DNA microarray 기법의 발달로 고전적 연구 방법과 달리 동시에 수천 수만개의 유전자의 표현을 검사하는 것이 가능하게 되었다. 본 연구에서는 알코올을 흰쥐의 신경아교종 세포에 처리했을 때 어떤 유전자의 발현을 조절하는지 DNA microarray를 이용하여 알아보고자 하였다.
방  법： 
   흰쥐 신경아교종 C6 세포주를 배양하여 에탄올 처리하고 총 RNA를 분리한 후 유전자 발현 양상을 조사하기 위해 cDNA microarray를 수행하였다.
결  과： 
   에탄올 처리군과 대조군간의 유전자 발현의 차이를 비교 분석한 결과 에탄올이 처리된 군에서 대조군에 비해 15개의 유전자가 발현이 증가하였고 12개의 유전자가 발현이 감소하였다. 발현이 증가한 유전자는 Orthodenticle(Drosophila) homolog 1, procollagen type Ⅱ, adenosine A2a receptor, GATA-bindning protein2를 포함하고 있었고, 발현이 감소한 유전자는 diacylglycerol kinase beta, PRKC, Protein phosphatase 1, clathrin-associated protein 17, nucleoporin p58, proteasome를 포함하였다.
결  론：
   흰쥐의 신경아교종 세포주에 알코올을 처치하였을 때 급성기에 알코올에 반응하여 발현이 증가하거나 감소한 유전자는 전반적으로 전사의 조절, 신호전달체계, 허혈성 뇌손상의 중재, 신경세포의 퇴행에 관여하는 것들이었다. 본 연구는 유전자 발현 시스템을 이용하여 에탄올에 반응하는 새로운 후보 유전자들을 관찰하였다는데 의의가 있다.