Korean Journal of Biological Psychiatry

서론
알코올 의존 및 남용은 사고, 폭력 등의 위험성이 매우 높고, 빈번한 관해와 재발이 특징적이며, 다양한 경과를 밟는 심각한 질환으로 일반 인구에서 유병률이 높은 장애 가운데 하나이다(American Psychiatric Association 1987). 또한 알코올 중독은 생물정신사회학적 입장에서 여러가지 요인으로부터 비롯된 이질적인 질환으로 생각되고 있으며(American Psychiatric Association 1987), 특히 가족, 쌍생아, 그리고 양자 연구 결과는 알코올 중독의 원인에 있어서 유전적 요인을 지지하고 있다(Cloninger등 1981；Goodwin 1979).
의학분야에서 분자생물학의 발전으로 초기 단일 유전자 장애에 국한되었던 연구가 최근에는 좀 더 복잡한 장애에 대한 연구로 활발히 진행되고 있다. 새로운 의학적 도구의 사용으로 알코올 중독과 염색체 4, 6, 11에 대한 특정 유전적 표지자와의 관련이 연합(association)과 연관(linkage) 분석에 의해 알려지게 되었다(Hill등 1975, 1988；Sigeta등 1980). 알코올 중독자들에서 명백하게 도파민 작용이 비정상이라는 것이 밝혀지면서 도파민 D2 수용체가 후보유전자(candidate gene)로 선택되었다. 근래에 도파민 D2 수용체가 알코올 중독을 포함한 신경정신과 장애와 관련된다는 보고가 있으며(Koob와 Bloom 1988；Lee등 1978；Seeman등 1984), 최근 연구(Blum등 1990)는 11번 염색체의 q22-23영역에 위치해 있는 도파민 D2 수용체 유전자와 심한 알코올 중독에서의 대립유전자와의 연합을 보고하였다. 그러나 도파민 D2 수용체와 알코올 중독사이의 연합은 많은 논쟁을 불러 일으키고 있다.
Blum등(1990)은 A1 대립유전자와 알코올 중독사이의 연관성을 처음으로 제시하였으며, 이 결과를 지지해주는 연구(Cloninger 1991；Comings등 1991；Noble 1993)가 보고되었다. 반면에, Bolos등(1990)은 D2 수용체 유전자와 알코올 중독사이에 연합이 없음을 발표하였으며, Cook등(1992), Gelernter등(1991), Goldman등(1992), Schwab등(1991), Turner등(1992)도 Bolos등(1990)을 지지해주는 결과를 보고하였다. Parsian등(1991)은 정상대조군과 심각한 의학적 문제를 가진 알코올 중독자들을 비교하였을 경우에만 A1 대립유전자와의 연합이 유의하였고, 심각하지 않은 알코올 중독자들과 비교한 경우에서는 유의하지 않았음을 보고하였다.
알코올 의존은 유전적으로 복잡한 질환이며, 유전자-환경간의 상호작용 역시 매우 규명하기 어렵다. 도파민 D2 수용체의 대립유전자와 알코올 중독사이의 연합에 대해 아직 논란이 계속되고 있지만, 이제까지의 연구를 기초로 알코올 중독의 유전에 대해 정리해보면 단일 유전자가 알코올 중독에 크게 영향을 미치는 것 같지는 않다.
본 연구는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction；PCR)을 이용하여 한국인 알코올 중독환자들에서 도파민 D2 수용체의 대립유전자와 알코올 중독과의 연관여부를 밝혀보고자 실시되었다.
연구 대상 및 방법
1. 연구 대상
연구 대상은 고려대학교 의과대학 부속병원 정신과, 부산 대남병원에서 DSM-Ⅲ-R(APA 1987) 진단 기준에 의하여 알코올 의존(alcohol dependence)으로 진단받은 67명의 남자 환자(27∼70세)를 대상으로 하였고, 기분장애, 정신분열증 그리고 기타 정신병적 장애를 가진 사람들은 제외하였다.
정상대조군은 발달과정에서 정신질환의 과거력 및 가족력이 없고, 두부외상 및 신경학적 질환력이나 알코올 중독 또는 약물남용의 과거력이 없는 사람들 중 연구 목적과 방법을 설명하여 자발적으로 참여한 건강한 남자 100명을 대상으로 하였다. 양군 모두에서 병력상, 이학적, 신경학적 검사상 이상소견은 없었다. 대조군의 연령분포는 대상 환자군의 분포와 차이가 없도록 구성하였다.
2. 연구 방법
1) Genomic DNA의 추출 및 정제
말초 혈액 1.5ml를 13,000rpm에서 1분간 원심분리하여 혈청을 제거하고, 남은 침전물(pellet)에 ACE shocking 용액(NH4Cl 8g, Na 2EDTAH2O 1g, KH2PO4 0.1g을 증류수 1L에 녹인 용액) 500μl을 넣고 서서히 3분간 흔들어 적혈구를 제거하는 과정을 2회 반복한다.
상층막을 깨끗이 제거한 후 남은 pellet에 400μl의 nuclei lysis 완충액[Tris(pH 8.0) 10mM, NaCl 400mM, EDTA 2mM]을 넣고 pellet을 잘 섞어준다. 여기에 10% SDS 27μl와 proteinase K 10μl를 첨가하고 56℃에서 2시간 동안 반응시키고 포화된 NaCl 135μl를 넣고 상온에서 15분간 방치한다. 13,000rpm에서 1분간 원심분리하여 상층액을 새 관에 옮긴 후 2배 부피의 에탄올을 넣고, 원심분리를 하고, 침전된 DNA를 회수하여 새 관에 옮긴다. 이 DNA를 70% 에탄올로 세척한 후 건조시키고, 증류수 100μl에 녹인다.
2) 중합효소연쇄반응
도파민 수용체 유전자에서 다형성(polymorphism)을 보이는 부위에 대해 중합효소연쇄반응을 시행하였다.
도파민 D2 수용체 유전자좌를 분석하기 위해 사용한 시발체 염기배열 순서는 다음과 같다.
5'-CCGTCGACGGCTGGCCAAGTTGTCTA-3'
5'-CCGTCGACCCTTCCTGAGTGTCATCA-3'
RCR은 25μl의 반응 용량으로 35주기를 수행하였고 반응조건은 다음과 같다.
Template DNA 50ng
Primer 25pmole
MgCl2 1.5mM
Tris-Cl(pH 8.3) 10mM
KCl 50mM
Gelatin 0.1%(w/v)
dNTP 200μM
Taq polymerase 1U
Total 25μl
반응온도와 시간은 94℃에서 10분간 1주기를 수행한 후 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초간 각각 35주기를 수행하였고 마지막으로 72℃에서 10분간 1주기를 수행하였다.
3) 증폭된 생성물의 분석
A1 절편과 A2 절편을 구별하기 위해 PCR 생성물을 도파민 D2 수용체의 경우 Taq I 제한효소로 절단하고 5% PAGE에서 전기영동한 후 ethidium bromide 용액으로 염색하여 자외선 투사기(ultraviolet transilluminator)에서 관찰하고, polaroid 카메라(polaroid, film 667)로 촬영하였다.
3. 통계분석 방법
알코올 중독자군과 정상인군에서 PCR 방법을 이용하여 도파민 D2 수용체의 DNA 다형성을 분석하였으며, 본 연구에 참여한 알코올 중독자들의 도파민 D2 수용체 대립 유전자 빈도와 정상 대조군들의 대립유전자 빈도를 Chi-square 검증법을 시행하여 분석하였다. 통계는 주로 대립유전자 빈도의 비교에 초점을 맞추었으며, Chi-square 값을 사용하였다. 또한 동형접합체와 이형접합체 두 군간의 차이에 대한 통계학적 분석은 연속교정(continuity correction)한 Chi-square 값을 적용하였다.
결과
1. 환자의 특성
환자군(남자 67명)의 연령분포는 27∼70세이었으며 평균 46.49±9.28세이었고, 정상대조군(남자 100명)의 연령분포는 27∼67세이었으며 평균 45.33±8.74세로 양군간의 유의한 차이는 없었다(Table 1).
환자들은 다양한 유형의 음주 성향을 보였으며, 또한 모든 환자가 연구당시 다양한 종류의 항우울제 및 항불안제 등의 약물을 복용하고 있었다.
2. 도파민 D2 수용체 유전자좌의 분석결과
도파민 D2 수용체 유전자좌를 중합효소연쇄반응을 이용하여 증폭한 결과 A1A1, A1A2, A2A2의 3가지 절편들이 증폭되었다. 알코올 중독환자 67명중 A1A1은 11명(16.4%), A1A2는 30명(44.8%), A2A2는 26명(38.8%)이었으며 동형접합체는 55.2% 그리고 이형접합체는 44.8%이었다. 정상대조군 100명 중 A1A1은 17 명(17.0%), A1A2는 42명(42.0%), A2A2는 41명(41.0%)이었으며 동형접합체는 58.0% 그리고 이형접합체는 42.0%이었다.
본 연구에 있어서 알코올 환자들의 A1 대립유전자 빈도는 0.39이었으며, 정상대조군의 대립유전자 빈도는 0.38이었다. 알코올 중독자들과 정상대조군에서 도파민 D2 수용체의 A1 대립유전자 빈도를 비교하여 보았으나, 양군간의 유의한 차이는 없었다(χ2=0.128, p>.05)(Table 2). 또한, 동형접합성과 이형접합성간에 유의한 차이는 없었다(Table 3, Fig. 1, 2).
고찰
알코올 중독과 도파민 D2 수용체의 A1 대립유전자 연합에 대해 많은 연구가 이루어지고 있다. Bolos등(1990)과 Parsian등(1991)은 도파민 D2 수용체가 질병의 원인이라기보다 질병의 표현을 조절하다고 제시하였다.
본 연구에서는 좀더 효율적인 연구방법인 PCR을 이용하여 알코올 중독과 도파민 D2 수용체의 A1 대립유전자와의 연합을 환자와 정상인에 대한 대조연구방법으로 검증하였으며, 그 결과 연합의 증거를 발견하지 못하였다. Bolos등(1990)도 알코올 중독자와 정상대조군사이에서 도파민 D2 수용체의 A1 대립유전자와 빈도 비교에서 유의한 차이가 없음을 발표하였는데 이는 본 연구 결과와 일치하는 것이다. 그러나 그들의 부정적 보고는 정상인집단에서 알코올 중독과 다른 정신병리를 구분하지 못하였고, 급성 의학적 장애 및 약물남용으로 인한 기능적 장해를 지닌 알코올 중독자들을 제외하였기 때문에 문제점을 가지고 있었다(Noble과 Blum 1991). 이어 Gelernter등(1991)은 Bolos등(1990)과 유사한 결과를 보고하였다. Gelernter등(1991)은 가장 높고, 가장 낮은 도파민 D2 수용체 A1 대립유전자 빈도를 가진 표본을 제거한 후에 자료를 재분석하여 알코올 중독자들과 정상대조군들사이의 차이가 통계적으로 유의하지 않았음을 보였다. Cook등(1992), Goldman등(1992), Turner등(1992)의 결과도 알코올 중독과 도파민 D2 수용체 유전자간의 연합을 지지하지 않았다.
그러나 Blum등(1990)은 35명의 알코올 중독자가 정상대조군보다 더 많은 빈도의 도파민 D2 수용체 A1 대립유전자를 가지고 있음을 보고한 바 있다(69% 대 20%). 이는 사후뇌조직에서 제한효소절편길이다형성(restriction fragment length polymorphism；RFLP) 분석을 통하여 도파민 D2 수용체 유전자의 A1 대립유전자와 알코올 중독과의 관계를 처음으로 보고한 것이었다. 즉 단일 유전자가 발달학상으로 복잡하고 유전적으로 이질적인 것으로 알려진 흔한 장애와 강하게 관련될 수 있다는 것을 보여준 것이다. 이어 Cloninger(1991)와 Noble(1993)도 Blum등(1990)의 보고를 지지해주는 연구결과를 발표하면서, 도파민 D2 수용체와 알코올 중독사이의 관계를 확정적으로 생각하였다.
한편 Bolos등(1990), Noble과 Blum(1991)의 연구를 종합하여 A1 대립유전자의 빈도와 알코올 중독의 심각도를 비교해보면, 알코올 중독이 심할수록 A1 대립유전자의 유의한 증가가 있음을 알 수 있다. Parsian등(1991)은 도파민 D2 수용체의 대립유전자와 심각한 의학적 문제를 가진 알코올 중독이 관련이 있음을 보고하였다. 10명의 심각한 의학적 문제를 가진 사람과 25명의 백인 정상대조군을 비교하였을 때 A1 대립유전자의 연합은 유의하였다(60% 대 12%). 그러나 덜 심각한 경우와의 비교에서는 유의하지 않았다. Blum등(1990)의 연구에서도 대상이 된 알코올 중독자들은 반복된 치료 실패를 경험하였으며, 결국 알코올의 만성적인 독성작용으로 사망한 심각한 의학적 문제를 가진 사람들이었다. 이는 A1 대립유전자의 조절 효과가 알코올 중독자에서 심각성을 증가시킬 수 있다는 해석을 가능하게 해준다.
Comings등(1991)도 A1 대립유전자가 넓은 범위의 행동학적 장애에 조절효과를 가질 수 있음을 보고하였다. 그들은 알코올 중독자들에서 A1 대립유전자가 유의하게 우세함을 발견하였으며, 도파민 D2 수용체 유전자의 A1 대립유전자가 알코올 중독의 주요 원인이 아닌 조절 유전자로서 작용하는 것 같다고 제시한 바 있다. 즉 A1 대립유전자가 알코올 중독의 발생 원인과 관련되었다기보다는 증상의 발현양상을 조절할 가능성이 있는 유전자임을 제시하는 것이다.
본 연구는 앞에서 언급한 바와 같이 알코올 중독자에서 의학적 합병증에 따른 심각도 차이를 구분하지 못한 제한점이 있으며, 발병시기, 인격적 문제와의 관련여부, 가족력 등을 고려하여 연구하지 못하였다. 알코올 중독에서 주된 관심사중 하나는 도파민 D2 수용체 대립유전자가 심각한 알코올 중독과만 관련이 있는 것인지 혹은 도파민 D2 수용체 대립유전자가 발병의 심각도를 증가시키는 조절 효과를 가지고 있는지이다(Blum등 1991；Cloninger 1991；Parsian등 1991). 그러나 아직 심각도에 대해 일치된 견해는 없다. 몇몇 연구자들(Blum등 1991；Parsian등 1991；Turner등 1992)에서는 심각하게 이환된 알코올 집단을 구분하기 위해서 의학적 합병증을 기준으로 사용하였고, Gelernter등(1991)은 금단 증상을 사용하였다. 또 진단에 있어서의 다양성이 존재한다. 정상인 집단에 있어서의 진단에 대한 논의(Cloninger 1991；Noble과 Blum등 1991；Smith등 1991)는 많이 진행되고 있다. 만약 Comings등(1991)의 보고대로 A1 대립유전자가 넓은 범위의 신경정신과적 장애에서 증가된다면, 아동기부터 성인기까지의 전반적인 평가가 선행되어야 할 것이다.
이제까지 각 연구들마다의 서로 다른 결과는 임상적 이질성으로 설명할 수 있다. 또한 자료분석을 하는데 어려움이 따르는데 그 이유로 알코올 중독의 아형태에 대해 일치된 진단기준이 아직 확립되지 못하였고, 각 연구에 따라 심각도의 측정이 다양하며, 민족적으로 잘 배합된 표본에 있어서의 심각도에 대한 자료가 거의 없는 것 등을 들 수 있다.
향후 알코올 중독의 심각도, 진단적 평가, 종족간 차이 및 다른 행동학적 장애와의 관련성을 고려하여 보다 체계화된 연구가 필요하다.
결론
본 논문에서는 알코올 중독과 도파민 D2 수용체의 A1 대립유전자사이의 연합을 검증하기 위하여 중합효소연쇄반응(PCR) 분석 방법을 사용하여 연구하였다. 그 결과 한국인에서 도파민 D2 수용체의 A1 대립유전자와 알코올 중독사이에 유의한 연합은 없었다. 그러나 알코올 중독의 심각도에 따른 차이를 고려하지 못하였고, 도파민 D2 수용체 A1 대립유전자와 알코올 중독에서 발생할 수 있는 다른 행동학적 장애 사이의 잠재적인 관련을 배제하지 못하였다.