Korean Journal of Biological Psychiatry

서론
사람을 비롯한 다세포 생물이 수정란이나 배아에서 발생하는 동안 필요한 세포는 세포 증식에 의해 새로이 생성되고 불필요한 세포는 apoptosis라고 불리우는 고도로 특성화된 suicide program에 의해 제거된다. Apoptosis는 형태학적으로나 생화학적으로 necrosis와 구별되며, apoptosis와 관련된 형태학적 변화로는 nucleoplasm과 cytoplasm의 수축, cytoplasmic membrane의 blebbing, 및 apoptotic body로 세포의 분절 등이 있다(Kerr 1971；Wyllie등 1980). 그리고, apoptosis의 생화학적 특징으로는 nucleosomal fragment로의 DNA 분절(Wyllie등 1980), interleukin-1β-converting enzyme(ICE：caspase-1) family와 같은 protease의 활성화(Schlegel등 1996 ；Duan등 1996；Wang등 1996), caspase family에 의한 poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)(Tewari등 1995；Nicholson등 1995), sterol-regulatory element-binding protein(SREBPs)(Wang등 1995), nuclear lamin(Lazebnik등 1995) 등과 같은 다양한 substrate의 분절 등이 포함된다.
Apoptosis는 Caenorhabditis elegans에서 많은 연구가 진행되어 왔으며(Hengartner와 Horvitz 1994), C. elegans에서 apoptosis에 관련된 두가지 유전자로는 apoptosis의 진행을 막는 ced-9 유전자(Hengartner등 1992)와 apoptosis의 시작에 필요한 protease을 coding하는 ced-3 유전자(Yuan과 Horvitz 1990)가 있다. Ced-3 단백질과 가장 유사한 mammalian protease인 caspase-3(Cpp 32；Fernandes-Alnemri등 1994)는 정상적인 상태에서는 32-kDa inactive precursor로 세포질에 존재하나, apoptosis가 진행되는 상태에서 17/11-kDa 또는 20/11-kDa의 활성화된 형태로 잘라진다(Nicholson등 1995；Wang등 1995；Schlegel등 1996). 그리고, 활성화된 Caspase-3는 116-kDa의 inactive PARP를 85/24-kDa의 활성화된 형태로 자른다(Tewari등 1995；Nicholson 등 1995).
Mammalian 세포에서 ced-9와 유사한 기능을 갖는 bcl-2는 많은 B-cell lymphoma의 t (14；18) translocation breakpoint에서 발견된 proto-oncogene이다. Bcl-2는 carboxyl-terminal hydrophobic domain를 통해 핵, endoplasmic reticulum, mitochondria의 membrane에 association되어 있으며(Akao등 1994；Janik등 1994；Lithgow등 1994), interleukin-3(Hockenbery등 1990；Tanaka등 1995)와 nerve growth factor 제거(Garcia등 1992；Batistatou등 1993)에 의해 유도된 apoptosis를 저해한다. 그리고, 산화성 스트레스에 의한 뇌 신경세포의 apoptosis도 자유 라디칼의 생성을 감소시킴으로써 저해하는 것으로 보고되어 있다(Boise등 1993；Yacoub등 1995).
본 연구는 세포의 사멸을 완화하거나 방어할 수 있는 apoptosis 저해 유전자인 bcl-2를 발현시킨 세포에서 에탄올과 같은 산화성 스트레스에 의해 세포사망이 저해되는지를 알아보고자 하였다.
실험방법
1. 세포배양
SK 세포는 서울대 이승기 박사로부터 얻었으며, DMEM(Dubecco’s modified eagle’s medium)배지에 10% fetal bovine serum(FBS), penicilin/streptomycin을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
2. DNA 조작 및 subcloning
pBluescript에 클로닝되어 있는 bcl-2 유전자를 진핵세포 발현벡터인 pcDNA3(Invitrogen)에 subcloning하여 transfection에 사용하였다. DNA나 plasmid DNA는 ethidium bromide-CsCl gradient 방법이나 Qiagen kit를 이용하여 분리하였다(Sambrook등 1989).
3. Bcl-2 유전자의 발현
SK 세포가 70% confluent 상태로 되었을 때, 8 μg의 bcl-2 유전자와 발현벡터인 pcDNA3 각각을 4μg의 calf thymus DNA(carrier DNA)와 함께 넣은 다음, calcium-phosphate 방법으로 침전시킨 후 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 그런 다음 PBS(Phosphate buffered saline)로 SK 세포를 씻은 뒤 DMEM배지를 넣고 다시 24시간 배양하였다. Bcl-2의 발현은 immunoblotting으로 확인하고, selection marker인 G418 (geneticin)로 stable transfection된 cell line을 선별하여 유지시켰다. 대조군으로 사용된 세포군은 pcDNA3 vector만 transfection시킨 세포를 사용하였다. Transfection된 SK 세포에서 bcl-2 유전자가 발현되는지 확인하기 위하여 Burnette등의 방법(1981)을 수정하여 immunoblotting을 수행하였다. 에탄올을 처리한 SK 세포는 extraction buffer(100 mM HEPES(N’-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethane sulfonic acid), 1% Triton X-100, 100mM DTT(Dithiothreitol), 1mM EDTA(Ethylenediamine tetraacetic acid), 1mM PMSF(Phenylmethylsulfonylfluorid), 50μg/ml leupeptin, 1μg/ml pepstatin)로 수확하였고, Lowry등의 방법(1951)으로 단백질을 정량한 뒤, 동량의 단백질을 12.5% SDS-PAGE(Sodiumdo-decylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에서 전기영동한 후 nitrocellurose filter에 이동시키고 Bcl-2에 대한 primary antibody와 alkaline phosphatase가 부착된 secondary antibody를 반응시킨 substrate(BCIP/NBT)를 처리하여 band를 확인하였다.
4. 세포의 사멸유도
SK 세포를 1.0×10 6 세포로 분주하여 24시간 배양한 후, oxidative stress를 생성하는 에탄올을 농도별로 이틀동안 처리하여 세포사멸을 유도하였다. 세포의 사멸은 MTT assay(Mosmann 1983)와 DNA fragmentation(Schwartz와 Osborne 1995)으로 확인하였다.
5. MTT assay
MTT assay는 Mosmann(1983)의 방법을 변형하여 수행하였다. 200μl당 1.0×10 3 세포로 배양된 96 well plate에 25mg/ml MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)용액 10μl을 첨가한 뒤 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양액을 제거하고 isopropanol에 녹아있는 0.04M HCl 100μl로 청색의 formazan 결정을 녹인 후, ELISA reader를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.
6. Genomic DNA fragmentation의 확인
Genomic DNA fragmentation의 확인은 Gross-Bellard 등의 방법(1972)을 변형하여 사용하였다. 에탄올을 처리한 SK 세포를 PBS로 세척한 후 lysis buffer(100mM NaCl, 10mM Tris-Cl pH8.0, 25mM EDTA, 0.5% SDS, 0.1mg/ml proteinase K)로 세포를 37℃에서 하룻밤 반응시켰다. 그런 다음 phenol로 단백질을 제거하고 genomic DNA만을 추출하였다. DNA fragmentation은 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다.
7. Caspase-1와 Caspase-3 유전자 발현 확인을 위한 RNA 추출과 RT-PCR(Reverse Transcriptase-polymerase Chain Reaction)
에탄올을 처리한 SK 세포를 PBS로 씻어준 다음 RNAzol TM을 처리하여 세포를 파괴하였다. 파괴된 세포 추출물에 chloroform을 첨가하여 얼음에 5분간 방치한 후, 원심 분리하여 상층액을 취하였다. 동량의 isopropanol을 처리하여 -70℃에 30분 방치하여 RNA를 침전시킨 뒤 70%의 에탄올로 세척하고 DEPC(Diethylpyrocarbonate)-treated water로 녹였다. 추출한 RNA 1μg과 MMLV(Moloney murine leukemia virus) reverse transcriptase를 이용하여 cDNA를 합성한 후, caspase-1와 caspase-3 primer와 cDNA 1μl를 이용하여 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분, 35 cycles으로 caspase-1와 caspase-3 DNA을 합성하였다. 합성된 caspase-1 와 caspase-3 DNA는 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다.
8. 에탄올처리에 의한 Caspase-3와 PARP 단백질 발현 관찰
Bcl-2를 발현시킨 세포군과 대조군에 대한 형태학적 분석과 살아있는 세포를 검증하기 위한 MTT assay 결과로부터 apoptosis가 일어날 것으로 기대되는 저농도의 에탄올을 처리하여 caspase 3와 PARP에 대한 polyclonal antibody로 immunoblotting을 실시하여 그 발현여부를 관찰하였다.
결과 및 고찰
Oxidative stress가 세포에 미치는 영향을 보기 위하여, apoptosis를 저해하는 bcl-2 유전자를 안정하게 발현시킨 SK 세포군과 대조군으로써 발현벡터만 발현시킨 세포에 에탄올을 농도별로 처리한 후 세포의 형태학적 변화와 MTT assay와 DNA fragmentation의 분석을 통하여 세포의 사망여부를 조사하였다. 에탄올처리로 인해 유도되는 세포사멸과 caspase-1 및 caspase-3의 관련여부를 알아보기 위하여 에탄올을 처리한 세포로부터 RNA를 추출한 뒤, RT-PCR을 수행하여 caspase-1와 caspase-3 mRNA 합성수준을 확인하였고, caspase-3와 PARP antibody룰 이용하여 이들 단백질이 세포사망 과정에서 활성화되는지를 알아보았다.
1. 에탄올 처리에 의한 세포사망 유도
에탄올이 SK 세포에 미치는 영향을 보기 위하여 에탄올을 농도별로 처리한 후 세포의 형태학적 변화를 관찰한 결과는 Fig. 1 및 2와 같다. 에탄올을 처리하지 않은 정상상태에서의 SK 세포는 방추사 모양으로 세포가 넓고 길게 세포배양접시 바닥에 부착된 상태로 성장하였다. 그러나 에탄올을 처리한 후의 SK 세포는 세포 자체의 방추사모양을 잃고 작고 불완전한 원형으로 변화되면서 배양접시 바닥에서 이탈 됨을 볼 수 있었다. 이로써 oxidative stress을 유도하는 것으로 알려진 에탄올의 처리(Oei등 1986)는 세포사망을 유도함을 알 수 있었다. 그리고 낮은 농도의 에탄올 처리시 bcl-2 를 발현시킨 SK 세포군(SK-Bcl-2)는 대조군(SK-pcDNA3)에 비해 비교적 에탄올 처리 이전의 형태가 그대로 유지되었다. 이로써 Bcl-2가 저 농도의 에탄올처리로 인한 세포사망을 저해하는 것으로 확인되었다. 에탄올 처리에 의한 세포사망을 형태학적 변화와 더불어 MTT assay를 통해 확인하였다. MTT assay 결과는 Fig. 3과 같으며, 높은 OD값은 세포의 사망이 적게 일어난 것을, 낮은 OD값은 세포의 사망이 많이 일어난 것을 의미한다. bcl-2를 발현시킨 SK 세포군은 에탄올을 처리하지 않았을 경우에도 0.102로 나타나 대조군(0.075)에 비해 높은 수치를 나타내는데 이는 Bcl-2가 에탄올 이외의 다른 요인들에 의한 세포 사멸을 저해하기 때문에 생존율을 높여주는 것으로 생각된다. Fig. 3에서와 같이 에탄올 처리 농도가 증가함에 따라 대조군과 bcl-2 발현 세포군의 경우에서 모두 세포사망이 증가하였으나 50mM이나 100mM 같은 비교적 낮은 농도의 에탄올 처리 시에 bcl-2 발현 세포군은 세포사망이 크게 증가되지 않아서 Bcl-2가 낮은 농도의 에탄올 처리에 의해 일어나는 세포사망을 저해하며 높은 농도의 에탄올처리에 의해 급격하게 일어나는 세포사망은 저해작용을 하지 못하는 것으로 생각되어진다.
2. DNA fragmentation
에탄올 처리로 인한 세포사망이 necrosis와 구별되는 apoptosis 현상인지를 확인하기 위하여 MTT assay나 세포형태를 통한 실험에서 얻어진 Bcl-2에 의한 세포사망 저해효과를 나타내는 에탄올 농도를 선택하여 대조군과 bcl-2 발현군의 두 세포군에 처리한 후 apoptosis의 확인을 위한 하나의 척도로써 DNA fragmentation을 조사하였다. 각 농도별로 에탄올을 처리한 후 세포로부터 genomic DNA를 추출한 후 DNA fragmentation을 조사한 결과는 Fig. 4와 같다. 처리된 모든 농도에서 대조군과 bcl-2 발현군에서 DNA fragmentation을 관찰할 수 없었다. 따라서 DNA fragmentation 결과로부터는 bcl-2에 의해 저해되었던 저 농도의 에탄올 처리에 의한 세포의 사망을 apoptosis 현상으로 단정할 수 없었다.
3. RT-PCR에 의한 caspase-1와 caspase-3 mRNA 발현의 확인
에탄올 처리에 의해 유도되는 세포사망 기작이 caspase-1와 caspase-3의 pathway를 경유하는지를 알아보기 위하여 caspase-1와 caspase-3의 mRNA와 단백질 발현 수준을 분석하였다. Caspase-1와 caspase-3 primer를 이용하여 각 대조군과 bcl-2 발현군의 두 세포주에서 전체 mRNA를 추출하여 RT-PCR로 caspase-1와 caspase-3에 해당하는 유전자의 mRNA를 확인한 결과 Fig. 5와 같이 두 세포주에서 각각 330bp의 caspase-1 PCR product와 320bp의 caspase-3 PCR product가 확인되어 caspase-1와 caspase-3는 단백질 합성 이후 과정에서 조절되는 것으로 생각할 수 있었다.
4. Immunoblotting에 의한 caspase-3와 PARP 단백질 발현의 확인
세포의 형태학적 분석과 MTT assay 결과와 같이 Bcl-2에 의해 저해되는 낮은 농도의 에탄올처리에 의해 유도되는 세포사망이 caspase-3와 PARP를 경유하는 apoptosis 현상인지를 확인하기 위하여 caspase-3와 PARP의 polyclonal antibody로 immunoblotting을 실시한 결과는 Fig. 6과 같다. Caspase-3와 PARP, 두 경우 모두 에탄올처리에 의한 단백질 활성이 유도되는 현상을 관찰할 수 없었다. DNA fragmentation 결과와 마찬가지로, 본 결과에서도 저 농도 에탄올 처리의 oxidative stress에 의해 유도되는 apoptosis를 관찰할 수 없었다.
결론
본 연구는 apoptosis 저해 유전자인 bcl-2가 에탄올에 의해 유도되는 세포사망을 저해하는지를 알아보기 위하여 bcl-2가 안정하게 발현되는 SK 세포군(SK-Bcl-2)과 발현벡터만 transfection시킨 대조군(SK-pcDNA3)에 에탄올을 처리하여 oxidative stress를 유도하고, 그에 따라 발생되는 세포사망 과정을 규명하고자 하였다. Transfection된 bcl-2 의 발현을 확인하기 위하여 Bcl-2에 대한 항체를 이용하여 immunoblotting을 실시한 결과 Bcl-2가 잘 발현되고 있음을 관찰할 수 있었다.
에탄올 처리에 의한 oxidative stress로 인하여 bcl-2 발현군과 대조군에서 모두 세포사망 비율이 현저하게 증가되었으나 낮은 농도의 에탄올이 처리된 경우 현미경 관찰에 의한 형태학적인 관찰을 통하여 bcl-2 발현군에서 세포사망이 저해되는 것을 볼 수 있었다. MTT assay 결과에서도 이와 유사한 경향을 보였는데, 에탄올처리에 의해 일어나는 세포의 형태학적 사망 현상에서와 같이 저 농도의 에탄올 처리시 bcl-2 유전자를 발현시킨 세포군에서 세포사망이 비교적 적게 유도되어 Bcl-2가 에탄올 처리로 인해 유도되는 세포사망을 저해하는 것을 알 수 있었다. 그러나 고농도로 에탄올을 처리한 경우에 유도되는 세포사망에서는 Bcl-2가 세포사망을 저해하지 못하는 것으로 나타났다. Bcl-2에 의해 저해되었던 저 농도 에탄올 처리에 의해 유도되는 세포사망이 apoptosis 현상인지를 확인하기 위하여 DNA fragmentation과 caspase-1와 caspase-3에 대한 RT-PCR 및 immunoblotting 실험을 수행하였다. DNA fragmentation 분석 결과 대조군과 bcl-2 발현군에서 모두 에탄올 처리에 의한 DNA fragmentation 현상을 관찰할 수 없어 이를 apoptosis 현상으로 볼 수 없었다. Caspase-1와 caspase-3 유전자에 대한 primer로 RT-PCR을 수행한 결과에서도 두 세포군 모두에서 mRNA가 비슷한 수준으로 합성되고 있는 것으로 나타났으며, caspase-3와 PARP에 대한 immunoblotting 실험에서도 두 단백질들의 활성화된 형태를 감지할 수 없어 에탄
올 처리에 의해 유도되는 세포사망을 apoptosis 현상으로 볼 수 없었다. Bcl-2가 apoptosis를 저해하는 단백질임을 고려할 때 에탄올에 의한 세포사망 기작에 대한 연구가 진행되어야 할 것으로 생각되어 진다.