Korean Journal of Biological Psychiatry

교신저자：김민정, 139-792 서울 성동구 행당1동 17
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서     론

   알코올리즘은 Benjamin Rush(1790)에 의하여 음주행위의 조절상실 상태로 최초 언급되었고 사고, 폭력 등의 위험성이 매우 높으며, 빈번한 관해와 재발이 특징적이고, 다양한 경과를 밟는 심각한 질환으로 일반 인구에서 유병률이 높은 장애 가운데 하나이다(American Psychiatric Association 1987). 또한 알코올리즘은 생물정신사회적 관점에서 여러 가지 요인으로부터 비롯된 이질적인 질환으로 생각되고 있으며(American Psychiatric Association 1987), 특히 가족, 쌍생아, 그리고 양자 연구 결과는 알코올리즘의 원인에 있어서 유전적 요인을 지지하고 있다(Cloninger등 1981；Goodwin 1979). 
   분자생물학의 발전으로 초기 단일 유전자 장애에 국한되었던 연구가 최근에는 좀 더 복잡한 장애에 대한 연구로 활발히 진행되고 있다. 알코올리즘과 염색체 4, 5, 6, 11, 12, 22에 대한 특정 유전적 표지자와의 관련이 연합(association)과 연관(linkage) 분석에 의해 알려지게 되었다(Hill등 1975, 1988；Schmidt등 1998；Koob와 Bloom 1988；Thomasson등 1991；Tiihonen등 1999). 
   Catechol-O-methyltransferase(이하 COMT)는 S-ade nosyl-L-methionine의 methyl기를 전이시켜 도파민의 전구체인 levodopa, 카테콜 스테로이드류, 노르아드레나린, 아드레나린과 같은 생물학적으로 활성을 띠며 독성이 있는 카테콜류를 광범위하게 불활성화시키는 효소이다. 또한 COMT는 포유동물의 뇌, 신장과 간조직에 폭넓게 분포하고 그 형태에는 두 가지가 있다. 첫 번째 형태는 221개의 아미노산을 가지는 가용성형(soluble form ; S)이고 두 번째 형태는 N-말단부위 아미노산이 50개 연장된 막결합형(membrane bound form ; MB)이며 두 형태 모두 염색체 22q11의 단일 유전자에 위치한다(Tenhunen등 1994). 이들 COMT 형태는 단일 상염색체상 유전좌(single autosomal locus)에 의한 측정에서 비내열성인 저활성형(COMT L)과 내열성인 고활성형(COMT H)의 두 가지 변이체로 존재하는 것으로 밝혀졌다(Grossman등 1992). 이 같은 현상은 108번째 아미노산이 바린에서 메티오닌으로 치환됨으로써 일어난다(Lotta등 1995). 촉매 활성도는 두 가지 모두 비슷하지만, 108번째 아미노산이 메티오닌으로 치환된 것은 생리적 온도에서도 내열성이 감소한다. 
   최근 연구(Tiihonen등 1999)에서 22번 염색체의 q11영역에 위치해 있는 COMT 유전자와 type 1(late-onset) 알코올리즘 환자(Cloninger 1987)와의 관련성을 입증한 연합연구가 보고된 바 있다. 그러나 COMT 유전자와 알코올리즘 사이의 연합은 아직 논쟁을 불러 일으키고 있다. Kauhanen등(2000)은 알코올리즘 환자뿐만 아니라 일반사회생활에서 음주를 하는 남성의 경우 COMT 유전자와 관련이 있다고 보고한 바 있다. 반면에, Ishiguro등(1999)은 알코올리즘환자군을 DSM-IV진단기준에 따라 분류하여 정상대조군과 연합연구를 실시한 결과 COMT 유전자와 알코올리즘 사이에 연합이 없음을 발표하였다. 
   알코올리즘은 유전적으로 복잡한 질환이며, 유전자-환경간의 상호작용 역시 매우 규명하기 어렵다. COMT의 대립유전자와 알코올리즘 사이의 연합에 대해 아직 논란이 계속되고 있지만, 이제까지의 연구를 기초로 알코올리즘의 유전에 대해 정리해보면 단일 유전자가 알코올리즘에 크게 영향을 미치는 것 같지는 않다. 
   본 연구는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction；PCR)을 이용하여 한국인 알코올리즘환자들에서 COMT 대립유전자와 알코올리즘과의 연관여부를 밝혀보고자 실시되었다. 

실험재료 및 실험방법

1. 연구대상 
   본 연구는 1998년 6월부터 1998년 10월까지 Y정신병원에 입원해 있는 남자 알코올리즘 환자 50명을 환자군으로 하고 정상대조군은 H병원에서 건강진단을 받아 신체적, 정신적 질병이 없는 18세에서 65세사이의 남자 53명을 대상으로 하였다. 환자군과 정상대조군 모두 한 가계에서 한 명씩만을 선정하였다. 대상환자의 기준은 2명의 정신과 전문의가 Diagnostic and statistical manual of mental disorders-IV(DSM-IV；American Psychiatric Association 1994) 기준에 의해 알코올리즘으로 진단하고, 이학적 소견이나 혈액검사 소견상 신체질환이나 영양결핍이 없으며, 과거 또는 현재 알코올리즘을 제외한 DSM-IV(American Psychiatric Association 1994)에 따른 다른 정신과적인 질환이 없고(단, caffein이나 nicotine등의 일반적으로 사용되는 물질을 사용하는 경우에는 연구대상에 포함시켰다.), 우울이나 불안 등에 의한 2차성 알코올리즘이 아닌 1차성 알코올리즘이며, 입원한지 최소 4주 이상이 되어 급성중독증상으로부터 회복된 18세에서 65세사이인 남자로 하였다. 

2. COMT 유전자의 분석 

1) Genomic DNA 추출법 
   정맥혈 5ml을 말초혈관에서 채취하여 EDTA tube에 넣어 처리한 뒤 24시간이내에 DNA분리가 불가능할 경우에는 -20°C에 냉동보관하였다. DNA 추출은 혈액 검체 1.0ml을 eppendorf tube에 나누어 넣고 phosphate buffer saline(PBS) 1ml을 첨가하여 잘 섞은 후 15,000rpm에서 약 15초 정도 원심분리하여 상층액을 버린 뒤 PBS 1ml을 첨가하고 섞어 침전을 녹인 후 15,000rpm에서 15초간 원심분리하였다. 원심분리하여 얻어진 침전이 흰색을 나타낼 때까지 위의 과정을 반복(약 6~9회)하였다. 적혈구가 제거된 흰색 침전이 얻어지면 상층액을 완전히 제거한 후 5% Chelex resin을 100μl 첨가한후 침전을 100°C에서 2분간 끓여 이를 원심분리하여 얻어진 DNA를 template로 사용하였다(Lee등 1997). 

2) COMT 유전자의 분석 
   본 연구를 위해 사용된 시발체는 GenBank accession number Z26491인 158번 codon을 포함하는 부분이며(Tenhunen등 1994) 시발체의 고안은 Primer Detective program(Clon Tech)을 사용하였다. 
   시발체는 Sense 시발체로 5'-CTCATCACCATCGAGATCAA-3'와 antisense 시발체로 5'-GATGACCCTGGTGATAGTGG-3'를 Tiihonen등(1999)에 의하여 제시된 방법으로 합성하여 사용하였다. Antisense 시발체로 중합효소연쇄반응은 100μM dNTP, 30ρmol primer(sense 및 antisense), template가 될 DNA 0.2μg/μl, 0.5 unit Taq DNA중합효소(Promega) 등이 첨가된 총부피 50μl인 용액으로 수행하였다. 반응은 95°C에서 3분간 1주기를 반응시킨 후, 95°C에서 30초, 55°C에서 30초, 72°C에서 1분의 반응을 30주기 반복한 후, 마지막으로 72°C에서 10분간 1주기를 반응시켰다. 
   중합효소연쇄반응으로 증폭된 DNA 10μl를 37°C에서 5 unit의 Nla III 제한효소로 3시간동안 처리 후 18% acrylamide 겔에 전개하여 120V에서 전기영동으로 전개시켰다. Xylene cyanole dye가 20cm의 유리판 끝까지 내려올 때까지 전기영동을 시행하였다. 전기 영동한 겔은 ethidium bromide로 5분간 염색한 후 자외선투사기에서 DNA 밴드를 확인하였다. 

3) 통계처리 및 분석 
   자료들에 대한 통계처리는 SPSS/PC+ version 8.0를 이용하였다. 알코올리즘군과 정상대조군에 있어서 COMT 유전자형과 대립유전자 빈도의 차이는 χ²-test를 시행하였다. 통계적 유의수준은 p<0.05로 하였다. 

결     과

   본 연구의 알코올리즘 환자군과 정상대조군의 COMT 유전자 빈도와 대립유전자 빈도를 표 1에 나타내었다. 표에 나타난 바와같이 알코올리즘 환자군과 정상대조군의 COMT 유전자 단편길이 다형성에 따른 대립유전자 형질(allele, χ²=2.145, d.f.= 1, p=0.153)과 유전자형의 빈도(genotype, overall χ²= 2.716, d.f.=2, p=0.257)사이에 통계적으로 의미 있는 차이는 발견되지 않았다 . 

고     찰

   알코올리즘은 여러 가지 원인에서 비롯되고 다양한 임상양상을 보이는 복합질환이다. 알코올리즘에 있어 유전적인 요인이나 생물학적인 요인이 더 중요한가 그렇지 않으면 환경적인 요인이 보다 더 중요한가에 대한 논의는 지금도 계속 진행되고 있는 중이다. 또한, 알코올리즘 환자가 가지는 다양한 임상양상 즉, 음주양상, 성격특성, 행동특성을 이해하기 위해서도 많은 연구들이 진행되고 있지만(Martin과 Sher 1994；Cloninger 1987；Blasfield 1985；Schuckit 1985) 아직까지는 뚜렷한 결론이 없는 상황이다. 
   최근 들어 분자유전학이 발달하면서 알코올리즘에 있어서 유전적인 측면에서의 연구들이 시도되고 있어 관심을 끌고 있다(Gade등 1998；Vanyukov등 1995). 물론 알코올리즘 환자의 이러한 다양한 임상양상은 여러 개의 서로 다른 표현형일 것으로 보이므로 어느 한가지 유전자만으로는 설명이 되지 않으며 다양한 다형성 유전좌(polymorphic gene loci)가 알코올리즘에 관여하는 것으로 생각된다(Cloninger 1990). 
   알코올리즘은 type 1과 type 2의 두 가지 아형으로 분류할 수 있다(Cloninger 1987). Type 2 알코올리즘은 발병 연령이 빠르고(early onset), 행동양상이 충동적이며 반사회적(impulsive antisocial behavior)인 점이 특징이다. 반면에 대다수 알코올리즘은 type 1으로 분류되고 발병 연령이 25세 이상으로 늦은 편이며(late onset) 행동양상은 반사회적인 면이 뚜렷하게 나타나지 않는다는 점이 대조적인 특징이다(Cloninger 1987). 사람의 체내 뇌상연구(brain imaging studies)에서도 도파민 신경전달(dopaminergic neurotransmission)과정의 기능장해가 type 1 알코올리즘 환자(Hietala등 1994；Volkov등 1996；Tiihonen등 1995, 1998)에서 일어난 반면, type 2 알코올리즘 환자에서는 일어나지 않는다(Tiihonen등 1995). 에탄올에 의해 유발되는 도취감(ethanol-induced euphoria)은 변연부위(limbic areas)에서 도파민의 급속한 방출과 연관되기 때문에(Yoshimoto등 1991), 저활성형 COMT 대립유전자를 가지고 도파민 불활성화율이 낮은 알코올리즘 환자는 고활성형 COMT 대립유전자를 가진 알코올리즘 환자보다 에탄올 의존성 발현에 보다 취약할 수 있다는 가정은 논리적이라 할 수 있다(Tiihonen등 1999).
   본 연구에서는 좀 더 동질의 유전적 소인을 가진 환자집단을 대상으로 특정 유전자와의 관련성을 알아보고자 가족력 유무, 음성 및 양성증상, 연성 신경학적 징후, DSM-IV 진단기준에 의한 임상형에 따라 환자군을 분류하여 COMT 유전자의 Nla III 다형성과의 연관성을 분석해 보았다. 그 결과 아형에 따른 COMT 유전자좌의 연관관계는 발견할 수 없었다. 그러나 본 연구에서는 각 아형에 포함된 환자의 수가 너무 작기 때문에 현재의 결과로 관련성을 완전히 배제할 수는 없을 것으로 보이며, 앞으로 더 많은 수의 환자를 대상으로 하는 연합 연구의 필요성을 절실히 느끼고 있다. 
   본 연구인 한국인 알코올리즘 환자와 정상대조군간 COMT 유전자의 Nla III 다형성에는 통계적으로 연합관계가 없음이 확인되었다. 본 연구결과는 여러 연관 연구에서 입증하였던 염색체 22q11 부위 혹은 COMT 유전자 좌위와 알코올리즘과는 아무런 관련이 없음을 보인다. 이는 COMT와 알코올리즘과의 연합연구를 수행하였던 Ishiguro등(1999)의 연구결과와 일치하는 부분이 있다. 그러나, 최근 알코올리즘 환자와 정상대조군간 연합 연구를 수행한 Tiihonen등(1999)의 연구결과와는 상반된 결과를 보인다. Ishiguro등(1999)이 실험한 부분은 Hoda등(1996)이 사용한 같은 시발체 염기서열인 COMT의 exon 1과 intron 2 사이부분이고 제한효소도 Nla III를 사용하여 본 연구와 상당부분 일치한다고 볼 수 있다. 이는 연관연구에서도 많은 연구자들이 염색체 22q11부분과 알코올리즘과의 연관관계를 입증하였으나(Kauhanen등 2000), 상대적으로 염색체 22q11부분이 연관되어 있지 않다는 증거도 다양하게 나오고 있는 실정이다(Ishiguro등 1999).
   이와같이, 연합연구는 환자와 대조군의 대립유전자의 빈도를 단순 비교하는 연구로 연구대상에 따라 다른 결과를 보이는 경우가 많아 외국의 경우 두 번 이상 같은 결과가 나와야 인정하는 경향이 있다(Byerley와 Coon 1995). 본 연구는 앞에서 언급한 바와 같이 알코올리즘 환자에서 합병증에 따른 심각도 차이를 구분하지 못한 제한점이 있으며, 발병시기, 인격적 문제와의 관련여부 등을 고려하여 연구하지 못하였다. 
   이제까지 각 연구들마다의 서로 다른 결과는 임상적 이질성으로 설명할 수 있다. 또한 자료분석에 어려움이 따르는데, 그 이유로 알코올리즘의 아형태에 대해 일치된 기준이 아직 확립되지 못하였고, 각 연구에 따라 심각도에 대한 자료가 거의 없는 것 등을 들 수 있다. 
   향후 알코올리즘의 발생기전을 설명하고 분류할 수 있는 다양한 생물학적 연구와 더불어 알코올리즘의 유전학적 연구가 동시다발적으로 진행되어야 할 것으로 생각된다. 

결     론 

   본 논문에서는 알코올리즘과 COMT 유전자사이의 연합을 검증하기 위하여 한국인 알코올리즘 환자군과 정상대조군을 대상으로 COMT 유전자의 Nla III 다형성과의 연합연구를 시행하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 본 연구에서 환자군과 정상대조군의 Nla III 다형성에 따른 대립형질과 유전자형질의 빈도는 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 그러나, 유전자 주위의 다른 표지자나 좀 더 유전적으로 동질한 환자군을 대상으로 한 추후 연구가 필요할 것으로 생각된다.