Korean Journal of Biological Psychiatry

교신저자：이민수, 136-705 서울 성북구 안암동 5가 126-1
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서     론

   정신분열병은 원인, 증상, 경과 및 예후 등에서 다양한 양상을 보이는 만성질환으로 이에 대한 설명을 위해 많은 연구들이 이루어져 왔으나 아직 명확하게 밝혀진 것은 없다. 현재까지 정신분열병은 신경전달물질과 이에 상응하는 수용체간의 상호관계, 호르몬과 신경펩타이드 등의 생물학적 요소나 유전자적 요소 등을 비롯한 여러 가지 인자들이 관여하는 이질적인 집단으로 이해되어지고 있다.
   항정신병약물의 발견이후 최근의 비전형적 약물의 개발까지 정신분열병의 치료에 많은 발전이 있었으나 환자에 따라 약물에 대한 반응은 차이가 많다. 이 때문에 그 동안 치료반응의 예측자를 알기 위한 수많은 연구가 지속되어 왔으며 지금까지 성별, 나이, 가족력과 같은 임상적 지표나 뇌의 구조적 이상, 뇌파의 양상, 약물의 혈중농도, 혈장 homovanillic acid(이하 HVA)나 5-hydroxyindoleacetic acid(이하HIAA) 농도 같은 생물학적 지표가 관심의 대상이 되어왔다. 그러나 아직까지는 불행히도 이러한 노력들이 큰 성공을 거두지 못하고 있는 상태이다.
   최근 들어 항정신병약물의 치료효과가 도파민 수용체의 차단과 관련이 있음이 밝혀지면서(Carlsson과 Lindquist 1963；Anden등 1970) 신경생화학체계의 이상에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 현재 그 보편타당성이 인정된 물질로는 도파민 외에도 세로토닌을 들 수 있다(Bleich등 1988). 이들의 변화를 연구하기 위해서는 중추신경계나 혹은 말초혈액에서 신경전달물질의 양적인 변화를 조사하는 것이 국내외적으로 가장 널리 받아들여지고 있다. 직접 뇌나 척수조직에서 이를 측정하는 것은 임상적으로 어려우나 다행히 각각의 대사물질인 HVA와 5-HIAA의 말초혈액의 농도가 이들의 뇌내 활성도를 반영한다고 알려져 있어(Davidson등 1987；Stanly와 Mann 1983) 치료반응의 예측자로서의 가능성이 꾸준히 제기되어 왔다. 지금까지 혈중 HVA와 5-HIAA 농도변화와 치료효과에 대해 수많은 연구들이 있었으나 대부분 1개월에서 3개월 미만의 단기적인 연구들이었으며 초발 환자를 대상으로 이루어진 결과들이어서 임상에서 흔히 접하는 만성 정신분열병에서의 장기적인 치료 예측자에 대한 정보를 주고 있지 못하고 있다.
   예측자를 밝히기 위한 또 다른 노력의 일환으로 분자유전학적 방법도 진행되어 왔는데, 지금까지 확인된 다섯 종류의 도파민 수용체의 아형(Seeman 1992)과 정신분열병간의 연관성을 규명하려는 연구들에서 아직 특정한 유전자는 밝혀지지 않고 있다(Clair등 1989；Sommer등 1993；Su등 1993；Wiese등 1993). 최근 들어 도파민 수용체의 다형성이 밝혀지면서 이들과 치료반응과의 상관성에 대한 노력들도 활발히 진행되고 있으나, 전통적으로 항정신병 약물의 주요한 작용부위로 생각되던 DRD2와 DRD4 수용체의 Allele와 clozapine에 대한 반응과의 비교를 시도에서는 유의미한 결과를 얻지는 못하는 등 아직 만족스러운 결과는 보고되고 있지 않다(Mana등 1998, Peter등 1994).
   DRD3 수용체는 다른 도파민 수용체에 비해 비교적 늦게 주목을 받았다. 도파민 D3 수용체가 변연계에 선택적으로 많이 분포되어있고(Socoloff등 1992) 만성 정신분열병에서 측두엽과 운동피질에서 D3 수용체와 mRNA 표현이 선택적으로 감소되어 있으며(Schmaus등 1993) 백서에 대한 동물실험에서 clozapine이 D3 수용체의 mRNA 농도를 높인다는 사실 등이(Buckland등 1993) 밝혀지면서, D3 수용체가 정신분열병의 신경화학적 이상에 지표자가 될 수 있다는 가능성에 대해 관심이 점점 높아져왔다(Socoloff등, 1990). 
   이에 D3 수용체의 다형성에 대해서도 많은 연구가 진행되어 왔으며 그 중 Ser-9-Gly 다형성에 의한 D3 수용체의 유전자형과 정신분열병과의 연관에 대한 연구가 가장 관심을 끌고 있다. 특히 지연성 운동장애와의 연관성이 여러 연구에서 밝혀졌는데 그 중 allele 2가 지연성 운동장애와 연관이 있다는 연구결과가 많이 보고되고 있다(Segman등 1999, Lovlie등 2000). 그러나 불행하게도 도파민 수용체에서 유전자의 구조적 변이와 항정신병약물에 대한 임상적 반응의 상관성을 찾으려는 이제까지의 여러 연구에서는 성공적이지 못하였으며(Shaikh등 1996, Rietschel등 1996) 각각 서로 다른 연구결과를 보고하고 있다. 
   이에 저자들은 대형정신병원에 장기간 입원하고 있는 만성 정신분열병 환자들을 대상으로 48주에 걸쳐 HVA와 5-HIAA 농도의 변화를 측정하고 도파민 D3 유전자형과 치료반응과의 상관성에 대해서도 알아보고자 하였다.

연구대상 및 방법

1. 연구대상 
   본 연구는 1998년 4월부터 1999년 3월까지 용인정신병원에 입원하고 있는 18세부터 65세 연령의 환자 중 정신장애 진단통계편람 제 4 판(DSM-IV)의 기준에 의해 정신분열병의 진단기준에 부합되는 총 116명의 환자를 대상으로 하였다. 한 가계에서 한 환자만 선택하였고, 구두 혹은 서면으로 연구에 동의한 환자를 대상으로 하였다. 연구기간 중 환자들에게는 전형적 항정신병약물만을 투여하였고 연구를 시작하기 전 wash-out period나 drug-free period를 가지지는 않았다.
   정신분열병 이외의 다른 합병된 정신질환이 있는 환자, 정신지체 환자, 알코올 중독 및 약물남용의 정신과적 과거력이 있는 환자, 선천적 기형이나 신경학적 질환이 있는 환자 등은 연구대상에서 제외하였다.

2. 연구방법

1) 유전자형 분석

(1) Genomic DNA의 정제
   말초 혈액 1.5ml를 13,000rpm에서 1분간 원심분리하여 혈청을 제거하고, 남은 pellet에 ACE shocking solution(NH₄Cl 8g, Na₂EDTAH₂O 1g, KH₂PO₄ 0.1g을 증류수 1l에 녹인 용액)을 500μl을 넣고 서서히 3분간 흔들어 적혈구를 제거한다. 상기 과정을 2회 반복한다.
   상층막을 깨끗이 제거한 후 남은 pellet에 400μl의 nucleic lysis Buffer[Tris(pH 8.0) 10mM, NaCl 400mM, EDTA 2mM]를 넣고 pellet을 잘 섞어준다. 여기에 10% SDS 27μl와 proteinase K 10μl를 첨가하고 56°C에서 2시간 동안 반응시키고 saturated NaCl 135μl를 넣고 상온에서 15분간 방치한다. 13000rpm에서 1분간 원심분리한 후 상층액을 새 관에 옮긴 후 2배 부피의 에탄올에 넣고 침전된 DNA를 회수하여 새 관에 옮긴다. 이 DNA를 70% 에탄올로 세척한 후 건조시키고, 증류수 100μl에 녹인다.

(2) 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction：PCR)을 이용한 유전자형의 판별
   도파민 D3 수용체 유전자에서 다형성을 보이는 부위에 대해 중합효소연쇄반응을 시행하였으며 사용된 시발체의 염기배열순서는 5`GCTCTATCTCCAACTCTCACA
   3’(sense)와 5’AAGTCTACTCACCTCCAGGTA3’(antisense)이었다.
   중합효소연쇄반응은 10mM TRIS-HCl(pH 8.3), 50mM KCL, 0.2mM dNTPs, 20pmol 각 primer, 1.5mM MgCl₂, 3U Taq polymerase 및 200ng template DNA를 혼합하여 전체 25ul 반응용량이 되게 하였다. 자동온도조절기를 이용해 94°C에서 10분간 1주기를 수행한 후 94°C에서 1분, 50°C에서 1분, 72°C에서 1분간 각각 35주기를 수행하였고, 마지막으로 72°C에서 10분간 1주기를 수행하였다.

(3) 증폭된 생성물의 분석
   A1절편과 A2절편을 구별하기 위해 PCR 생성물을 MluI제한효소로 절단하고 2% 한천 겔에서 전기영동한 후 ethidium bromide 용액으로 염색하여 자외선 투사기(ultraviolet transilluminator)에서 관찰하고 polaroid 카메라(polaroid, film 667)로 촬영하였다.

2) 혈장 HVA 및 5-HIAA 농도 측정
   모든 환자는 전날 자정부터는 금식하도록 하였으며 오전 8시(아침식사 및 투약 전)에 상완에서 정맥혈 10cc를 EDTA-tube에 채취한 후 원심분리하여 분리된 혈장을 분석하기까지 -70°C에서 보관하였다. 매 3개월마다 5회 채혈하여 측정하였다.
   혈장 HVA 및 5-HIAA의 농도측정은 Seegal등(1986)의 방법을 다소 수정하여 전기화학 검출기(electrochemical detector)가 갖추어진 high performance liquid chromatography(이하 HPLC)를 이용하였다.

   (1) HPLC 기기：HPLC 기기는 Waters사(Waters Associates, Milford, MA, USA)의 model 510 pump, model 717 plus auto-sampler, Temperature control module(TCM)과 Shiseido사(Tokyo, Japan) model 2005 pulsed amperometric detecter(PAD)를 이용하였다. 또한 기기의 작동과 자료의 분석을 위하여 Bus LAC/E card와 연결된 Millenium 20lO Chromatography Manager software가 구비된 IBM PC로 분석하였으며, 분석용 column으로는 Shiseido사(Tokyo, Japan)의 250×4.6mm I.D., 5μm particle size, reversed phase C₁₈ column을 사용하였고 column temperature는 30°C를 유지하였다.

   (2) 시약 및 표준 용액 등 모든 시약은 분석용 등급을 사용하였으며 sodium phosphate(dibasic), citric acid, isovanillic acid, EDTA(ethylene diamine tetra-acetic acid, disodium salt)는 Sigma사(St. Lours, MO, USA), acetonitrile, tetrahydrofuran은 Burdick and Jackson사(Muskegon, MI, USA), lyophilized serum은 Bio-Rad사(Segrate Italy), perchloric acid는 Wako Pure Chemical사(Osaka, Japan), phosphoric acid는 E. Merck사(Darmstadt, Germany)로부터 구입하였고, Milli-Q water system(Millipore Corp, Bedford, MA, USA)으로 제조된 3차 증류수를 사용하였다. 표준용액은 Sigma사로부터 HVA와 5-HIAA를 공급받아 사용하였으며, stock용액은 lmg/ml의 농도로 준비하여 -70°C에 보관하였다가 실험할 때마다 희석하여 사용하였다.

   (3) 혈장 HVA 및 5-HIAA의 분석조건：혈장내의 HVA 및 5-HIAA는 perchloric acid를 사용하여 추출하였다. 냉동보관 되어 있는 lml의 sample을 4°C에서 서서히 해동하여, internal standard인 5-Hydroxy-indole-2-carboxylic acid l00ng을 넣고 충분히 vortex mixing한 후, 5Oμl perchloric acid를 넣은 다음 수십 초간 vortex mixing한 후 30분간 4°C에 방치하여 혈장 단백질을 완전히 침전시키고 l3,000×g로 15분간 4°C에서 원심분리하였다. 분리 후 얻어진 상층액만을 취하여 40μl를 HPLC system에 주입하였다.
   이동상의 조성은 0.06M sodium phosphate(dibasic), 0.03M citric acid, 0.0053mM EDTA가 혼합된 phosphate buffer용액 945ml와 50ml의 acetonitrile에 5ml의 tetrahydrofuran을 혼합하여 lL로 준비하였고, pH는 3.1이 되도록 조정한 후 0.22μm pore size의 filter로 여과 후 ultrasonicator로 30분 동안 탈기하여 사용하였다. 이동상의 유속은 1ml/min이었으며, 사용된 PAD의 전극전위는 +800mV vs Ag/AgCl의 electrode potential에서 lnA의 감도로 측정하였다. 상기 측정방법에 의한 혈장 HVA, 5-HIAA의 농도는 환자의 혈장에서 얻어진 정점의 높이를 표준시약과 internal standard가 첨가된 drug free serum에서의 정점의 높이와의 비(ratio)로 내부표준시약 계산방식을 사용하여 원하는 농도를 구하였다.

3) 임상증상의 평가
   임상증상의 평가는 기준선과 48주에 각각 Positive and Negative Syndrome Scale(이하 PANSS)를 기초로 시행하였다. PANSS는 Kay 등(1987)이 만든 엄격한 기준에 따라 시행하였다. 치료반응군의 기준은 PANSS 점수가 기준 점수에 비해 48주 후 20% 이상 감소된 경우로 정의하였다. 연구 시작 전에 본 평가에 참여하는 평가자들은 평가자간 신뢰도를 높이기 위해 평가척도에 대한 workshop에 참석하여 video tape를 통하여 평가자간 일치도가 0.8 이상인 상태로 안정될 때까지 연습시행을 하였다. 

4) 통계분석
   치료반응군과 비반응군 간에 있어서 각각의 유전자 형(a1a1, a1a2, a2a2)들의 빈도를 비교하기 위하여 chi-square 검증법을 사용하였으며 대립유전자의 빈도와 0주와 48주 사이의 HVA 및 HIAA의 농도변화 역시 동일한 방법으로 분석하였다. 각 군에서 base line의 HVA 및 HIAA의 농도는 t-test를 사용하였다. 통계프로그램은 SPSS/PC+ version 10.0을 사용하였고 모든 통계적 유의수준은 0.05이하로 하였다.

결     과

   본 연구는 126명이 등록되어 시작하였으나 10명이 추적조사 실패로 중도 탈락하여 총 116명(남자 70명, 여자 47명)이 연구를 종결하였다. 반응군은 30명(남자 18명, 여자 12명) 비반응군은 86명(남자 51명, 여자 35명)이었으며 각 군의 평균연령은 각각 39.03±5.69세, 39.60±7.65세이었고, 발병연령은 각 22.53±5.50세, 22.60±6.20세로 유의미한 차이는 없었다. 또한, 남녀비, 아형에 따른 분류, 이전의 입원횟수, 가족력 유무 및 약물용량(클로로프로마진의 역가로 치환한 용량기준시)에서도 통계학적 유의성은 발견되지 않았다(표 1).
   반응군과 비반응군간의 HVA와 5-HIAA 농도의 baseline간의 비교는 Independent t-test를 이용하였는데 각각의 p-value가 0.844와 0.805로 유의미한 결과를 보이지 않았다. 또한, 반응군 내에서 baseline과 48주 후의 각각의 차이에 대한 paired sample t-test에서도 p-value 0.652로 역시 무의미한 결과를 나타내었다. 
   유전자형의 분포를 보면 A1A1형은 57명으로 45.7%, A1A2형은 47명으로 40.5%, A2A2형은 16명으로 13.8%를 나타냈으며 대립유전자 A1과 A2의 발현율은 각각 65.9%와 34.1%였다(표 2).
   DRD3 각 유전자형에 따른 치료반응은 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다(표 3). 하지만, 대립유전자를 비교한 결과에서는 A1 allele를 가진 군이 A2 allele를 가진 군에 비해 치료에 반응을 하지 않는 비율이 유의하게 높았다. 

고     찰

   본 연구에서 저자들은 임상적으로 흔히 경험하지만 아직까지는 연구가 미약한 만성 정신분열병 환자에서 치료반응을 예측할 수 있는 지표자를 찾고자 하였으며 지금까지 여러 연구들에서 상관성이 보고된 HVA와 HIAA 농도, 그리고 DRD3 유전자형을 대상으로 48주간의 변화를 측정하였다. 
   표 1에서도 알 수 있듯이 발병연령, 질환의 이환기간, 남녀비, 아형에 따른 분류, 이전의 입원횟수, 가족력 유무 및 약물용량 등의 임상적 지표자는 반응군과 비반응군 사이에 유의미한 차이가 없어 치료반응의 예측자로서 의미가 없었다. 
   이전의 연구들에서 보면, HVA의 경우 약물투여 전 혈장 HVA의 농도가 높을수록 치료에 좋은 반응을 보인다는 보고들(Putten등 1989；Chang등 1990；Mazure등 1991；Davidson등 1991)도 있었고, 치료에 따른 혈장 HVA 농도변화가 치료반응과 유의한 상관관계를 보인다는 보고들(Davila등 1988；Javaid등 1990)도 있었으며, 양성증상과 상관성이 있다는 연구결과(Picker등 1990)도 있다. 이러한 점은 항정신병약물의 치료효과와 도파민 체계의 변화와의 상관성을 강하게 시사하고 있다. 5-HIAA의 경우에도 많은 연구가 진행되었는데 치료반응이 양호한 군과 불량한 군 사이에 기준 혈장 5-HIAA농도에서 유의한 차이가 없었다는 연구들(Alfredsson과 Wiesel 1990)에서부터, 낮은 혈장 5-HIAA 농도군에서 치료 후 BPRS의 변화폭이 크다는 국내의 보고(김승현등 1995)에 이르기까지 그 결과가 다양하다.
   본 연구에서는 만성 정신분열병 환자를 대상으로 48개월간 추적 검사하였는데 HVA와 5-HIAA의 농도변화와 임상 증상의 변화 사이에서 관련성을 찾을 수 없었다. 이는 전형적 항정신병약물을 투여하였을 때 투여 초기에는 혈장 HVA 농도가 증가하나(Davidson등 1987；Davila등 1988) 수주간 투여한 후에는 기준치 농도 수준이나 그 이하로 감소했다는 보고(Bowers등 1989；Chang등 1988)나 치료반응이 양호한 군과 불량한 군 사이에 기준 혈장 5-HIAA농도에서 유의한 차이가 없었다는 연구들(Alfredsson과 Wiesel 1990)과 일치하는 결과이다. 아마도 본 연구에 참여한 환자들은 만성 정신분열병으로 인해 오랜 기간 항정신병약물을 복용하여 이미 단가 아민의 농도가 항정상태에 도달해 있었던 점이 그 이유 중 하나라고 생각된다. 즉, 만성 정신분열병에서의 치료효과는 도파민이나 세로토닌의 혈중 농도의 변화에 의한 것이라기보다는 사회재활치료나 가족의 지지정도 등 다른 인자와 더 연관이 되어있음을 추정할 수 있다. 
   유전자형의 분포에 대한 이전의 연구에서 보면 정신분열병 환자에서는 A1A1형이 정상 대조군에 비해 유의하게 많고 A2A2형이 적으며 allele 1이 더 높은 비율로 나타난다는 결과를 보여주면서 allele 1을 가진 군에서 정신분열병의 위험도가 50%나 증가한다고 보고하고 있다(Sanober등 1996). 아직 국내에서는 정상 대조군에 대한 자료가 없고 본 연구에서도 대조군에 대한 연구를 하지 않아 결과를 이끌어낼 수 없지만, 정신분열병 환자에서는 A2A2형이 상대적으로 낮은 비율(13.8%)을 보였고 A1 allele를 가진 군이 더 많았다(65.9%). 향후 정신분열증의 발병 위험인자로서의 DRD3 유전자 다형성에 대한 대조군과의 연구가 필요하리라 사료된다.
   본 연구에서 DRD3 유전자형에 따른 치료반응은 유의한 결과가 나오지 않았는데, 이는 D3 수용체의 Ser-9-Gly 다형성과 정신분열병과는 연관이 없다는 이전의 연구(Chia등 1997)와 같은 결과다. 하지만, 133명의 정신분열병 환자에 대한 한 연구에서는 D3 수용체 유전자의 Ser-9-Gly 다형성에 의한 genotype 중 A1A1형이 치료 비반응군에 더 많다고 보고하고 있다(Shaikh등 1996). 또한, allele 2가 정신분열병 환자에서 많이 발견되고 빠른 발병연령과 연관이 있으며 genotype 2-2형이 정신분열증의 위험을 높이고 항정신병약물에 대한 반응이 적다는 위와는 반대의 연구결과(Ebstein등 1997)도 있어 이에 대해서도 앞으로 더 많은 연구가 필요하리라 생각된다. 
   비록 유전자형에 대해서는 의미 있는 결과가 나오지 않았지만, 대립유전자를 비교한 결과를 보면 A1 allele를 가진 군에서 치료에 대한 반응이 나쁜 것으로 나타났다. 이는 allele 1이 정신분열병의 가족형에 많고 좋은 예후와 관련이 된다는 연구결과(Maziad등 1997)와는 반대되는 결과이기는 하나, A1A1 유전자형이 불량한 예후와 관련된다는 이전의 보고(Shaikh등 1996；Sanober등 1996)와 연관되어 예측자로서의 가능성을 보여주는 결과라고 할 수 있겠다.
   본 연구는 몇 가지 문제점을 가지고 있다. 우선 본 연구가 한 특정병원에 장기간 입원해 있는 환자들을 대상으로 하였기 때문에 치료불응성 환자의 비율이 높은 등 전체 정신분열병 환자에게 일반화시키기 힘들다는 점을 지적해야 하겠다. 둘째, 환자마다 복용하는 약물의 종류나 용량, 그리고 유병기간이 광범위하고 이질적이어서 만성 정신분열병 환자라고 단순히 묶어서 접근한다는 것이 무리수가 많았다. 셋째, 본 연구에 포함된 환자들은 만성 정신분열증 환자들이기 때문에 조사 이전에 항정신병약물을 투여 중이었으며 실제 임상에서 접하는 환자들에 대한 예후를 알기 위한 연구가 목적이었으므로 연구 시작 전 따로 wash-out period를 두지 않았다. 따라서 연구 시점에서는 이미 대사물의 농도도 항정상태에 도달해 있었을 것이며 이로써 항정신병약물 투여 전후의 변화를 비교할 수 없었고, 약물 투여전의 기저 농도가 없었기 때문에 좀더 정확한 비교가 이루어질 수 없었다. 하지만, 장기간 추적 검사를 하였기 때문에 만성 정신분열병 환자에서 장기적인 항정신병약물 투여시 단가 아민의 대사물질 변화의 추이를 알아볼 수 있었다.

결     론

   본 연구는 치료중인 만성 정신분열병 환자의 48주간의 치료반응을 평가하여 대상군을 반응군, 비반응군으로 나누고 각각에서 HVA와 HIAA의 농도변화 및 도파민 D3 수용체 대립유전자군에 대해서 치료 반응과의 상관성을 밝혀 이러한 것들이 치료반응의 예측자의 역할을 할 수 있는가를 알아보고자 하였다.
   만성 정신분열병 환자들에서 임상적 지표나 단가 아민의 농도변화는 예측자로서 의미가 없는 것으로 생각되며, DRD3 유전자형에 따라서도 치료반응의 유의미한 차이가 나타나지 않았다. 다만 allele 1을 가진 환자는 치료에 반응이 좋지 않을 것임을 예측할 수 있겠다. 향후 본 연구의 문제점을 보완한 연구를 통해 약물을 투여하지 않은 정신분열병 환자에서 단가 아민 대사물의 농도를 측정하여 치료 전 도파민의 활성을 알아보고 항정신병약물을 투여한 후 추적 관찰을 통하여 장기 치료 후의 결과와 비교 관찰하는 연구가 필요할 것이다. 그리고 본 연구가 만성 정신분열병 환자에 대한 치료 예측에 대한 연구가 부족한 현실에서 D3 수용체와 관련된 향후 연구에 방향을 제시할 수 있을 것으로 기대한다.