Korean Journal of Biological Psychiatry

교신저자：양병환, 133-792 서울 성동구 행당동 17
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서     론

   우울증은 높은 유병율을 나타내며, 자주 재발하고 만성화되는 경향이 있어, 선진국들에서 기능장애(disability)의 2번째로 중요한 원인으로 꼽히는 중요한 정신질환의 하나이다.¹⁾ 따라서 우울증 치료제 개발과 연구가 끊임없이 이루어지고 있으며, 많은 항우울제들이 소개되어 왔으나, 아직도 우울증 환자의 소수는 현재 사용되고 있는 항우울제에 대한 효과를 보지 못하고 있다.²⁾ 보다 효과적인 우울증 치료를 위해, 오랫동안 우울증의 병태생리와 항우울제의 작용기전을 밝히기 위한 생물학적 연구들이 지속적으로 진행되어 왔고, 여러 가지의 다양한 가설들이 제시되었다.
   우울증의 첫 생물학적 가설은 단가아민 고갈 가설(monoamine depletion hypothesis)이다.³⁾ 이 가설은 단가아민 신경전달물질인 세로토닌(serotonin)과 노르에피네프린(norepinephrine)이 시냅스에서 고갈되어 우울증이 나타난다는 것이다. 그러나 정상인에서는 세로토닌이나 노르에피네프린의 고갈이 우울증상을 유발시키지 못한다는 점과 항우울제 투여로 단가아민의 수준은 급격하게 증가되지만 치료 반응을 나타내기까지에는 3~4주의 일정한 시간이 경과되어야 한다는 점 등에서 이 가설은 더욱 복잡한 과정이 존재한다는 한계에 부딪히게 되었다.⁴⁾
   이러한 의문을 해결하기 위해 단가아민 수용체 민감성 가설(monoamine receptor sensitivity hypothesis)이 제안되었다.⁵⁾ 이 가설은 단가아민이 고갈된 상태가 지속되면 단가아민 수용체의 수가 증가되는 수용체의 상향조절(up-regulation)이 일어나 우울증이 유발되고, 항우울제를 투여하면 단가아민의 지속적인 유리 혹은 증가가 일어나며 단가아민 수용체의 수를 감소시키는 하향조절(down-regulation)로 인해 치료효과를 나타낸다는 것이다. 그러나 이 가설도 모든 항우울제가 수용체의 하향조절을 유발하지 않았다는 점,⁶⁾ 하향조절에 걸리는 시간이 치료반응이 나타나는 시기보다 더 빨랐다는 점,⁷⁾ 우울증의 효과적인 치료방법인 전기충격요법은 수용체의 상향조절을 나타낸다는 점⁸⁾ 등에서 한계에 부딪히게 되었다. 그 동안 신경전달물질, 신경조절물질, 신경전달물질 수용체, 신경내분비계 등에 대한 신경생화학적 연구가 가장 주된 관심을 받아왔으나, 아직까지 우울증의 병태생리를 확실히 설명하기에는 여러 가지 한계를 보이고 있어 새로운 신경생물학적인 접근이 필요하다고 하겠다.
   최근에는 분자생물학, 신경영상술, 세포병리학의 발달과 더불어 우울증의 병태생리와 항우울제의 작용기전을 분자 혹은 세포 수준에서 이해하려는 시도에 관심이 높아지고 있다. Duman 등(1997)⁹⁾은 스트레스와 우울증 그리고 항우울제의 작용기전을 세포내 신호전달경로(intracellular signal transduction cascade)와 신경가소성(neural plasticity)의 개념으로 설명하려는 새로운 시도를 하였다. 그가 제시한 분자 및 세포 가설(molecular and cellular theory)에 따르면, 심한 스트레스는 해마신경원의 위축과 사망뿐만 아니라 신경조직발생(neurogenesis)을 억제하여 해마(hippocampus)의 구조적 변화와 기능의 장애를 초래하는데, 이런 신호전달경로의 장애와 신경원 적응(neuronal adaptation)의 실패가 우울증을 유발하게 되며, 항우울제는 이를 회복시키는 역할을 한다는 것이다. 이런 분자 혹은 세포 수준에서의 연구는 그동안 단가아민 혹은 수용체 연구로는 규명되지 않았던 항우울제의 작용기전과 우울증의 병태생리를 설명할 수 있는 새로운 정보를 제공하리라 기대되고 있다.
   본 연구에서 사용한 벤라팍신(venlafaxine)은 세로토닌-노르에피네프린 재흡수 차단제(serotonin-norepinephrine reuptake inhibitor；SNRI)계열의 새로운 항우울제로, 주로 세로토닌과 노르에피네프린의 재흡수를 차단하며 고용량에서는 도파민의 재흡수도 차단한다. 이런 이중작용 기전으로 심한 우울증에도 효과적이며, muscarinic, cholinergic, H-histaminergic 혹은 α-adrenergic 수용체들과의 친화력이 없어 이들 수용체들과 반응할 때 발생하는 각종 부작용이 생기지 않는 장점이 있다고 알려져 있다.¹⁰⁾¹¹⁾ 또한 β-adrenergic 수용체를 조기에 하향 조절하여 빠른 효과를 기대할 수 있는 약물로 여겨지고 있다.¹⁰⁾ 이전에 연구된 여러 항우울제들과 마찬가지로 벤라팍신도 신경조직발생(neurogenesis)에 영향을 미치리라고 추측되고 있으며,⁹⁾ 본 연구에서는 벤라팍신을 처리한 후 PC12 세포(rat adrenal pheochromocytoma cell)의 분화를 관찰하여 이를 확인하려 하였다. 물론 약물에 의해 일어나는 인체의 변화를 단일세포에서 알아본다는 것이 한계가 있지만, 이는 여러 가지 환경 변수에 관한 통제가 제대로 이루어지지 않는 생체실험보다 우선되어야 하는 기초연구라고 생각한다.
   PC12 세포는 교감신경 분비세포로 catecholamine, dopamine, norepinephrine을 생산한다. 이 세포에 향신경성인자(neurotropic factor)중에 하나인 신경성장인자(nerve growth factor, 이하 NGF)를 3일간 처리하면 dopamine이 6배 이상 증가하는 것으로 보고 되었고,¹²⁾ 7일간 처리한 세포에서는 5-HT₃ 수용체를 발현시킨다는 보고가 있다.¹³⁾ 이와 같은 신경전달물질(neurotransmitter)의 발현 변화 외에도 신경돌기(neurite)가 성장하고 연접소포(synaptic vesicle)도 형성되는 소견이 함께 보고 되었다.¹³⁾
   본 연구는 국내에서는 최초로 이루어지는 항우울제가 신경조직발생에 미치는 영향을 확인하려는 시도로, PC12 세포에 향신경성인자(neurotropic factor)인 NGF만 처리했을 때와 NGF와 벤라팍신을 함께 처리했을 때 세포의 신경돌기 변화에 어떤 영향을 미치는지를 관찰하였다. 아울러 벤라팍신이 신경돌기 변화에 영향을 준다면 어떤 기전에 의해 영향을 미치는지 분자유전학적 수준에서 연구하는 기초 자료를 제공하는 기회를 만드는데 본 연구의 목적이 있다.

재료 및 방법

1. 실험재료
   흰쥐(New England Deaconess Hospital strain white rat) 부신(adrenal gland)의 갈색세포종(pheochromocytoma)에서 분리하여 신경세포주로 확립된 PC12 세포를 한양대 생화학과 프로테옴 연구실에서 분주 받아 사용하였다.
   세포 배양에 사용된 collagen은 Sigma Chemical Co.(St. Louis. MO. USA)에서, NGF, RPMI 1640 배지, 마혈청(horse serum)과 우태아혈청(fetal bovine serum)은 Gibco BRL(Gaithersburg. MD. USA)에서 구입하여 사용하였다. 
   항우울제인 벤라팍신(venlafaxine HCL)은 일동제약의 협조를 받았다.

2. 실험방법

1) 세포배양
   PC12 세포는 60×15mm 크기의 배양접시(culture dish)에서, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum)과 5% 마혈청(horse serum)이 포함된 RPMI 1640 배지를 첨가한 후, 37℃, 5% CO2 상태가 유지되는 인공 배양기에서 배양하였으며, 격일로 배지를 교환해 주었다.

2) Collagen 처리 및 NGF 처리 
   60×15mm 배양접시에 0.075% collagen solution 3ml을 넣은 후, 37℃에서 24시간 동안 보관하였다. 다음날 collagen 함유 배양 접시를 serum-free 배지로 씻은 후, PC12 세포를 0.5×10⁶cell 씩 분주하였다. 여기에 serum 함유 배지를 3ml 첨가하여 37℃, 5% CO₂상태로 24시간동안 배양하였다. 24시간 배양한 PC12 세포에서 serum 함유 배지를 제거한 후, NGF를 20ng/ml로 처리한 serum-free 배지로 8일간 배양하였으며, 격일로 배지를 교환해주었다.

3) 벤라팍신 처리
   (1) 일동제약에서 협조 받은 분말(powder)로 된 벤라팍신(분자량：313.86)을 3차 증류수에 녹여 10mM의 stock으로 만들었다. 이를 0.45μm pore size의 syringe filter를 이용하여 filtration한 후 각각의 농도에 맞게 사용하였다.
   (2) 벤라팍신이 세포의 신경돌기 성장에 미치는 영향을 확인하기 위하여, NGF를 처치한 PC12 세포를 위에서 기술한 것과 같이 8일간 배양한 후, NGF와 함께 벤라팍신을 1μM과 5μM로 각각 처리한 세포를 24시간과 48시간 동안 배양하였고, 대조군으로 NGF만을 처리한 세포를 역시 24시간과 48시간 동안 배양하였다.
   (3) 벤라팍신이 세포의 신경돌기 성장을 촉진하리라는 가정 하에, 벤라팍신 농도별 세포의 신경돌기 성장 길이를 비교하기 위하여, 8일간 NGF를 처리한 PC12 세포에 NGF와 함께 벤라팍신을 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20μM로 각각 처리하여 24시간과 48시간 배양하였다.

4) 세포의 신경돌기 길이 측정
   벤라팍신의 농도별로 분류된 각 배지마다 임의로 세 부분을 선택하여 24시간과 48시간에 100배 배율의 위상차현미경에 보이는 시야(field)를 확인하고 사진으로 기록을 하였다. 임의로 선택된 세 부분에서 신경돌기가 가장 길게 자란 순서대로 총 9개의 신경세포를 선택하여 각각의 신경돌기 길이를 측정한 후 이를 평균화하여 농도별로 비교하였다. 만일 하나의 세포에서 여러 개의 신경돌기가 자라나거나 분지(branch)가 형성된 경우는 이를 모두 합산하여 신경돌기의 길이로 간주하였다.

5) 통계처리
   대조군(0μM) 신경세포와 벤라팍신 1μM, 5μM로 처리된 후 배양된 신경세포의 신경돌기 길이를 24시간과 48시간에 측정하여 평균±표준오차(단위：mm)로 나타낸 후 그 차이를 비교하였다. 실험 결과에 대한 통계적 유의성은 분산분석(Analysis of variance, ANOVA)을 시행하여 유의수준 p<0.05에서 차이를 보았다. 자료는 SPSS version 11.0 통계프로그램을 사용하여 분석하였다.

결     과

1. NGF만 처리한 세포와 벤라팍신을 함께 처리한 세포의 신경돌기 길이변화
   PC12 세포에 8일간 NGF를 처리한 후, 다시 24시간동안 NGF만을 계속 처리하여 배양한 세포와 벤라팍신을 1μM과 5μM의 농도로 함께 처리하여 24시간동안 배양한 세포의 신경돌기 길이를 비교하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 우선 대조군인 NGF만을 처리한 세포군(A)에서 신경돌기 길이를 측정한 결과, 가장 잘 자란 9개 신경세포의 신경돌기 길이 평균은 11.89±2.62(10^-2) mm이었다. 또한 벤라팍신 1μM을 함께 처리한 세포군(B)에서 신경돌기 길이를 측정한 결과, 신경돌기 길이 평균은 13.56±1.81(10^-2)mm로 대조군에 비해 길어진 소견을 보였으나 통계적으로 유의미한 소견은 아니었다. 하지만, 벤라팍신 5μM을 함께 처리한 세포군(C)에서는 신경돌기의 길이 평균이 19.00±6.27(10^-2) mm로 대조군이나 1μM 처리군보다 유의미하게 길어진 것이 관찰되었다(p<0.05)(표 1).
   48시간 동안 NGF 단독 혹은 벤라팍신을 함께 처리한 경우에도 위와 유사한 결과를 얻었다. 즉, NGF만을 계속 처리한 세포보다 벤라팍신을 함께 처리하여 배양한 세포의 신경돌기 길이가 더 길었으며, 1μM보다 5μM을 처리했을 때의 신경돌기 길이가 더 길었다(p<0.05)(표 1).
   또한 벤라팍신을 24시간 처리한 세포보다 48시간 처리한 세포의 신경돌기 길이가 더 길었다(그림 1).

2. 벤라팍신의 농도별 세포의 신경돌기 변화
   벤라팍신을 6μM의 농도로 처리했을 때 24시간과 48시간 배양한 세포 모두에서 신경돌기의 길이가 가장 길었다. 벤라팍신을 6μM 이하의 농도로 처리할 때 까지는 벤라팍신 농도와 신경돌기 길이가 비례하였으나, 벤라팍신의 농도를 8μM 이상 높여 처리할 때부터는 신경돌기의 길이가 벤라팍신 농도에 반비례하여 줄어들었으며, 12μM일 때부터는 신경돌기의 길이가 줄었을 뿐만 아니라 세포도 많이 사멸함이 관찰되었다(그림 2).

고     찰

   본 연구는 일차 배양한 PC12 세포에서 항우울제인 벤라팍신이 신경돌기의 분화에 미치는 영향을 관찰하고 그 기전을 추측함으로써, 우울증의 병태생리와 항우울제의 작용기전을 분자생물학적 수준에서 연구하는 기초 자료를 마련하기 위해 실시하였다. 최근 정신의학의 생물학적 연구에 분자생물학적 방법이 도입되면서, 동물을 이용한 생체실험뿐 아니라 기초적인 연구를 위해 일차 배양한 세포도 실험에 이용하고 있다. 하지만 국내에서는 위와 같은 방법으로 항우울제의 작용기전을 연구한 보고가 없었다. 따라서 저자는 일차 배양한 PC12 세포에 항우울제인 벤라팍신을 NGF와 함께 처리한 후 세포의 신경돌기 길이 변화를 관찰함으로써 항우울제가 신경세포 분화에 어떤 영향을 미치는지 알아보는 연구를 국내에서는 처음으로 시도하였다.
   본 연구의 결과들을 종합해 보면 다음과 같다. NGF만 처리한 대조군에 비해 벤라팍신을 함께 처리한 후 배양한 세포의 신경돌기 길이가 더 길게 자라남을 관찰하였다. 이는 항우울제가 신경조직발생(neurogenesis)을 촉진시킨다는 이전 연구들을 지지하는 소견이라 할 수 있다. 또한 벤라팍신을 1μM 처리했을 때보다 5μM 처리했을 때 신경돌기 길이가 더 길게 자랐다는 결과에 따라, 벤라팍신 농도가 신경세포 분화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 벤라팍신 농도를 달리하여 실험해 보았다. 그 결과 벤라팍신을 6μM의 농도로 처리했을 때에 신경돌기의 길이가 가장 길었고, 6μM보다 높은 양을 처리했을 때는 24시간과 48시간 모두 신경돌기 길이가 현저하게 줄었으며, 24시간보다는 48시간 처리한 경우 사멸하는 세포의 수도 더 늘어남을 관찰할 수 있었다. 이는 벤라팍신의 농도가 일정농도 이상으로 높아지면 세포독성을 나타내어 신경돌기 형성을 막을 뿐만 아니라 세포의 사멸을 유도함을 추정할 수 있다.
   최근 분자생물학의 발달과 더불어 항우울제가 신경조직발생을 포함한 개념인 신경가소성(neural plasticity)에 영향을 미친다는 연구들이 활발히 진행되고 있다. Duman 등(1997)⁹⁾은 스트레스로 인한 특정 뇌 부위의 신호전달경로(intracellular signal transduction cascade)의 장애와 신경원 적응(neuronal adaptation)의 실패가 우울증 등의 스트레스와 연관된 질환을 유발하게 되며, 항우울제가 이 과정에 작용하여 이를 회복시키는 역할을 한다는 이론을 제시하였다. 현재 세포내 신호전달경로에는 cyclic adenosine monophosphate(cAMP) 신호전달경로[cAMP-CREB cascade]와 향신경성인자(neurotrophic factor) 신호전달경로가 알려져 있다. 본 연구에서는 항우울제에 의한 이런 세포내 신호전달경로의 변화를 밝혀보려는 시도를 하였다.
   본 연구에 사용된 PC12 세포는 NGF 처치시에 분화와 동시에 신경돌기를 성장시키는데, 이때 NGF에 반응하는 유전자만도 800여개에 이르는 것으로 알려져 있다.¹⁴⁾ NGF에 의해 발현이 조절되는 대표적인 유전자로 Trk(transmembrane receptor protein tyrosine kinase) 수용체를 들 수 있다. Trk 수용체는 TrkA, TrkB, TrkC로 나눌 수 있는데, 특히 TrkA가 NGF와 우선적으로 결합한다. 이 Trk 수용체는 높은 친화력을 가지고 선택적으로 신경조절인자와 결합하여 kinase domain을 활성화시키는데, Trk 수용체의 kinase는 세포내에 위치하며 자신의 tyrosine을 자기인산화(autophosphorylation) 시킴으로써 활성화되고, Grb2와 p21 ras를 통해 신호를 전달한다. NGF가 TrkA를 활성화시킨 뒤 Ras→Raf→MEK→MAPK가 차례로 인산화 되고, MAP kinase는 SRE(serum responding element)에 결합하는 SRF(serum responding factor)와 p62를 인산화 시켜 immediate early gene인 c-fos의 전사를 일으킨다. 그리고 신경전달물질의 탈분극화와 세포내로의 Ca²⁺ 유입은 CaMK(calmodulin kinase)를 활성화시켜, CREB (Ca²⁺/cAMP responding element binding factor)를 인산화 시키고, 이것이 또한 c-fos의 전사를 일으키게 한다. 한편 CaMK는 SRF도 인산화 시켜 전사를 조절한다. 이러한 전사인자의 발현은 다시 신경세포 특유의 단백질들의 발현을 조절하여 신경세포의 생존을 증진하고 분화를 일으키게 된다.¹⁵⁾
   위에서 언급된 tyrosine은 dopamine과 norepinephrine의 아미노산 전구체로, 자기인산화 과정을 통해 NGF에 의한 PC12 세포의 신경돌기 성장에 관여하는 중간물질로 작용한다. 또한 벤라팍신은 신경세포내의 dopamine과 norepinephrine의 재흡수를 막아주는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서 NGF만 처리한 세포보다 NGF와 벤라팍신을 함께 첨가한 세포의 신경돌기 길이가 더 길었다는 것은 tyrosine이 자기인산화 되면서 신경세포의 생존과 분화에 매개역할을 하는 과정에 벤라팍신이 관여하는 것으로 추측할 수 있다.
NGF에 의해 발현이 조절되는 또다른 유전자로 SOD1 (superoxidase dismutase)을 들 수 있다. 항우울제들이 SOD1 mRNA의 발현을 증진시키며,¹⁶⁾ 이 유전자에 의해 발현되는 단백질은 oxygen free radical들의 불활성화를 거쳐서 세포의 oxidative stress와 신경손상을 감소시켜 신경을 보호하는 역할을 한다고 알려져 있다.¹⁷⁾
   이렇듯 NGF는 PC12 세포에 신경돌기 성장과 동시에 신경보호까지 해주는 역할을 하는 것으로 이미 밝혀져 있으며, 본 연구를 통해 벤라팍신도 NGF와 같이 신경돌기 성장을 촉진시키는 것을 확인함으로써 NGF와 비슷한 경로를 통해 신경돌기 성장을 촉진시킬 것으로 추측할 수 있겠다. 또한 추후 벤라팍신의 신경보호와 관련된 역할에 대한 연구도 기대할 수 있을 것으로 보이며, NGF가 신경세포에 작용하는 유전자적 기작들을 토대로 벤라팍신의 유전자적 작용기작들을 연구하는 근간을 마련하는 효과를 기대할 수 있다. 
   이상과 같이 저자는 일차 배양한 PC12 세포를 통해 항우울제인 벤라팍신이 신경돌기의 분화에 미치는 영향을 관찰하고 그 기전을 추측함으로써, 우울증의 병태생리와 항우울제의 작용기전을 분자생물학적 수준에서 알아보려는 시도를 하였다. 본 연구는 단일 세포를 대상으로 하였기 때문에 복잡하고 상호 유기적인 연결통로를 갖고 있는 인체에서도 동일한 결과가 나타날 지는 추후 확인이 필요한 과제라 할 수 있다. 또한 항우울제의 분자생물학적 작용기전에 대한 가설을 유추하는 데도 현재 우리가 알고 있는 지식으로는 한계가 있었다. 향후 복잡한 세포내 신호전달과정의 조절 경로를 밝히고 이들이 조절하는 유전자를 규명하는 것이 미래 연구의 과제가 될 것이다.