Korean Journal of Biological Psychiatry

서론
도파민 수송체는 도파민을 분비하는 신경세포 synaptic terminal에 존재하는 막단백으로서, 도파민이 synaptic cleft로 분비되면 post-synaptic neuron막에 존재하는 수용체(dopamine receptor)에 결합하여 그 신호 전달 작용을 마치고 유리된 후 도파민 수송체에 의해 pre-synaptic neuron으로 재흡수되어 지는데, 이와 같은 방식의 재흡수가 도파민 신호전달을 조절하는 주작용이라고 알려지고 있다. 도파민 수송체는 분자량 60,000∼80,000으로서 12개의 세포막 통과 부위(transmembrane domain), 5개의 세포막내 고리 (intracellular loop) 및 6개의 세포막외 고리(extracellular loop)로 구성되어 있으며, 특히 2번째 세포막외 고리가 다른 고리에 비해 크고 N-말단과 C-말단이 모두 세포내에 존재한다는 구조적 특징을 가지고 있다(Amara와 Kuhar, 1993；Giros와 Caron, 1993；Uhl와 Hartig, 1992).
근자에 도파민 수송체에 관해 큰 관심이 집중되고 있는데 이는, 도파민 수송체가 파킨슨씨병, 정신분열증, 및 Gilles de la Tourette syndrome등의 신경, 정신과적 병변과 깊은 관련이 있을 뿐만 아니라, 각종 신경독이 본 수송체를 통해 신경세포에 침입함으로써 그 세포독성을 나타내며, 코카인, 암페타민, 삼환계 항우울제(tricyclic antidepressant) 등의 정신 신경계용 약물들도 도파민 수송체의 도파민 수송작용을 저해함으로서 그 약리작용을 나타냄이 밝혀졌기 때문이다(Bergman등 1989；Ritz등 1987；Spealman등 1989). 특히 도파민 수송체는 코카인 중독과 깊은 관련이 있는데, 향정신성 약물인 코카인에 대한 self-administration 실험(Bergman등 1989；Ritz등 1987)에 의하면 코카인중독시 생기는 코카인 의존성은 mesolimbic system에 존재하는 도파민 수송체에 본 약물이 작용함으로써 생기는 것으로 설명되어 지고 있다(Kubar, 1992).
도파민이외의 다른 monoamine 신경전달물질도 각각에 대해 높은 친화력을 보이는 수송체가 존재하여 중추신경계의 기능유지에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있으며(Glowniak등 1993；Ramamoorthy등 1993) 최근 이들에 대한 분자생물학적인 연구의 결과로 GABA 수송체의 cDNA가 cloning된 것(Guastella등 1990)을 필두로 noradrenaline, serotonin 및 도파민 수송체의 cDNA가 cloning되어(Pacholczyk등 1991；Blakely등 1991；Hoffman등 1991；Kilty등 1991；Shimada등 1991；Usdin등 1991) 이들의 구조와 기능에 관한 많은 부분이 밝혀지고 있다.
현재 정신과 영역에서 사용되고 있는 대부분의 약물은 단일한 작용기전에 의하기 보다는, 복합적인 약리 작용에 의해 그 약효를 나타내는 것으로 알려지고 있다. 현재 상용되고 있는 항정신병 약물(antipsychotic drugs)은 postsynaptic neuron 세포막에 존재하는 도파민, serotonin, norepinephirine 신경전달물질에 대한 수용체(receptor)의 길항제로 작용하여 이들 신호 전달의 차단이 그 주 작용 기전으로 알려져 있다. 일부 항정신병 약물은 항우울 작용을 지니며, 삼환계 항우울제가 도파민 수송체의 상경적 길항제라는 점을 고려할 때 항정신병 약물이 도파민 수송체 활성에 영향을 미칠 가능성은 충분하다고 사료되나, 아직까지 이에 대한 보고는 없다. 이에 본 연구에서는 cloning된 소의 도파민 수송체 cDNA(Usdin등 1991)를 원숭이 신장세포인 CV-1 세포에 도입하여 도파민 수송체를 영구히 발현하는 세포주를 확립하고 이를 이용하여 항 정신병 약물이 도파민 수송체의 도파민 수송 작용에 미치는 영향을 조사하여 비교 분석하였다.
연구대상 및 연구방법
1. 도파민 수송체 영구 발현 세포주 CV(bDAT)세포 제조
소뇌 도파민 수송체 cDNA(Usdin등 1991)를 cytomegalovirus(CMV) promoter를 가진 eukaryotic expression vector인 pRc/CMV(Invitrogen사)의 multiple cloning site중 HindIII와 NotI site사이에 삽입하여 expression plasmid pRc/CMV-bDAT를 제조하였으며, 이를 대장균주 DH5α에 calcium chloride방법(Hanahan 1983)에 의해 형질전환(transformation)하고 형질전환된 균주로부터 plasmid를 alkali lysis 방법(Birnboim와 Doly 1979)에 의해 분리하였으며 polyethylene-glycol 방법(Sambrook등 1989)에 의해 그 plasmid를 정제하였다.
60mm 배양접시에 원숭이 신장세포인 CV-1세포, 1-2 x 10 5개를 접종하여 DMEM배지로 18∼24시간 배양하여 세포가 바닥에 30∼50%정도 깔리도록 하였다. OPTI-MEM I 배지 100ul에 pRc/CMV-bDAT plasmid DNA가 2ug 포함되어 있는 용액 A와 OPTI-MEM I 배지 100ul에 10ul의 Lipofectin R(BRL사)이 함유된 용액 B를 섞어 실온에서 15분간 방치하였다. 세포는 2ml의 OPTI-MEM I 배지로 한번 세척하고 위에서 제조한 Lipofectin-DNA용액에 1.8ml의 OPTI-MEM I을 가하여 세척된 세포위에 가한 후 18시간 CO2 배양기에서 배양하였다. 4ml DMEM으로 배양액을 교환하고 48시간 더 배양한 후 5개의 배양접시에 나눠 Geneticin R(BRL사)이 400ug/ml로 함유된 DMEM배지에서 배양하였다. Geneticin R으로 선택된 세포 군락(colony)중 임의로 11개만 선택했으며, 각각으로 부터 도파민 수송능을 평가하여 가장 높은 활성을 보인 세포군락(CV(bDAT))을 배양하여 다음 실험에 사용하였다.
2. 도파민 수송체 활성 측정
도파민 수송체의 수송능을 측정하기 위하여, 24-well plate에 도파민 수송체 유전자가 transfection된 세포주, 1-2×10 5 개를 접종하여 하룻밤동안 Geneticin R이 함유된 DMEM배지에서 키운후 세포를 modified Krebs-Ringer HEPES(m-KRH) 완충액 [25mM HEPES(pH7.4), 125mM NaCl, 4.8mM KCl, 1.2mM KH2PO4, 1.2mM MgSO4, 5.6mM glucose, 1mM CaCl2, 1mM ascorbic acid, 100uM pargyline] 0.5 ml로 세척하고 완충액 존재하에서 10분간 37℃에서 반응하였다. 완충액을 제거한 후 완충액으로 제조한 0.1, 0.2 또는 0.5uM [3H]dopamine 용액(51mCi/mmole, Amersham사), 100ul을 각 plate에 가하고 37℃에서 10분간 반응하였다. Plate에 미리 차게해 둔 완충액을 가하여 반응을 중단시킨 후, 완충액 0.5ml로 3번 세척하여 세포안으로 수송되지 못한 [3H]dopamine를 제거하였다. 0.5M NaOH용액, 100ul로 세포막를 파괴시키고 이를 수거하여 세포질내로 수송된 [3H]dopamine의 양을 scintillation counter(Tri-Carb 2010, Packard사)로 측정하였다. 또한 본 연구에서는 도파민 수송체가 도입되지 않은 동일한 수의 CV-1세포로 동일한 방법으로 dopamine 수송능을 측정하여 이를 비특이적 수송치로 하였다.
3. 항정신병 약물이 도파민 수송체 활성에 미치는 영향
각 약물을 최종 농도가 0.01uM에서 500uM 되게끔 0.1Um [3H]Dopamine 용액에 첨가하고 도파민 수송능을 측정함으로서 각 약물이 도파민 수송능에 미치는 영향을 평가하였다. 각 약물의 저해 강도를 평가하기 위해 도파민 수송을 50% 감소시키는 약물 농도인 IC50치를 구하였으며 이미 도파민 수송체에 대한 저해 효과가 입증된 향정신성 약물(코카인 유도체인 CFT, GBR12909와 항우울제인 nomifensine, clomipramine, desipramine, imipramine, amineptine, amitryptyline, kinupril)의 저해 강도도 동일한 조건에서 평가하여 비교하였다. 이때 사용된 CFT, GBR12909, nomifensine, clomipramine, desipramine, imipramine, amineptine, amitryptyline, kinupril, clozapine, risperidone, haloperidol, bromperidol, clopixol, mesoridazine, thioridazine, chlorpromzine시약은 Reasearch Biochemical International(RBI)사에서 구입하였다.
결과
1. 소 도파민 수송체의 활성 및 특성
본 연구에서 확립한 도파민 수송체 영구 발현 세포주 CV(bDAT)는 현저히 높은 도파민 수송능을 보여, 50 nM의 [3H]dopamine을 첨가하였을 때 37℃에서 10분동안 1.28 pmol/10 5 cell의 [3H]dopamine을 세포안으로 수송하였으며, saturation analysis상 도파민 수송에 관한 본 수송체의 K m치(Michaelis constant)는 991.6 nM로 분석되었다(Fig. 1).
2. 향 정신성 약물이 도파민 수송능력에 미치는 영향
코카인 유사체인 CFT의 IC50치가 0.27uM로 가장 낮아 측정한 향 정신성 약물중 도파민 수송 저해능이 가장 강력한 것으로 평가되었으며 그 다음은 역시 코카인 유사체인 GBR12909로 0.45uM이었다. 항 우울제의 도파민 수송 저해능은 코카인 유사체보다는 크지 않았으며, 항 우울제 중에는 nomifensine이 IC50치가 0.86uM로서 가장 강력한 도파민 수송 저해제였으며, 그 다음은 amitryptyline 4.01uM, clomipramine 4.64uM, imipramine 7.35uM, 및 desipramine 9.82uM 순이었으며, kinupril과 amineptine은 각각 21.86uM, 52.22uM로 항우울 약물 중에서 낮은 활성을 보였다(Table 1).
3. 항 정신병 약물이 도파민 수송능력에 미치는 영향
본 연구에서 사용한 모든 항정신병 약물도 향정신성 약물처럼 도파민 수송체에 의한 도파민 수송능을 저해하는 것으로 평가되었으나 그 저해 강도는 대체적으로 향 정신성 약물에 비해 낮았으며 각 약물들의 약리작용 분류에 따른 차이는 보이지 않았다. 가장 높은 활성을 보인 thioridazine은 IC50치가 3.44uM이고 bromperidol은 6.59uM로 삼환계 항우울제인 imipramine이나 desipramine과 비슷한 수준으로 평가되어 사용한 항정신병 약물중에는 가장 높은 도파민 수송 저해능을 나타낸 반면, clozapine과 mesoridazine의 IC50치는 96.34uM, 165.97uM로 사용한 항정신병 약물중 그 저해 강도가 가장 낮게 평가되었다. 그 밖의 clopixol은 9.85uM, haloperidol은 15.83uM, risperidone은 17.38uM, chlopromazine은 17.52uM의 순으로 도파민 수송 저해능을 보였다(Table 1, Fig. 2).
고찰
도파민 수송체 활성은 일정수의 세포에 [3H]dopamine을 가하여 세포내로 흡수된 [3H]dopamine양을 측정함으로써 평가하였는데 이때 사용된 완충액에는 125 mM의 Na이온을 포함시켜 수송체의 수송작용을 원활하도록 하였으며 도파민등의 monoamine 신경전달물질을 분해하는 monoamine oxidase에 대한 저해제인 pargyline을 포함시킴으로써 첨가된 [3H]dopamine의 분해를 최소화하였다. 이와 같은 실험 조건에서 발현된 소뇌 도파민 수송체의 도파민 수송능은 현저히 높았으나, 도파민 수송체의 일반적인 특징인 코카인(CFT) 결합능은 나타나지 않았다. 본 연구 체계에서 발현된 도파민 수송체의 도파민 수송능의 K m치는 991.6nM로서 본 연구와 같은 방법으로 흰쥐 도파민 수송체 cDNA를 HeLa cell에 transfection한 Kilty등의 연구(Kilty등 1991)에서의 K m치인 885nM과 비슷하였다.
코카인 유도체, 삼환계 항우울제 등의 향정신성 약물은 일반적으로 도파민 수송체의 도파민 수송능을 특이적으로 저해하는 것으로 알려져 있다(Horn AS, 1990；Kilty등 1991；Shimada등 1991； Usdin등 1991；Giros등 1992). 이에 본 연구에서는 코카인 유사체인 GBR12909와 CFT, 삼환계 항 우울제인 nomifensine, clomipramine, imipramine, desipramine, amineptine, amitryptyline 및 kinupril의 도파민 수송체의 저해정도를 평가해 봄으로써 기존의 연구 결과를 새롭게 정립함과 동시에, 아직 그 효과가 전혀 입증된 바 없는 항정신병 약물의 도파민 수송체 활성 효과에 대한 기준으로 삼고자 하였다. 그 결과 도파민 수송체의 도파민 수송을 CFT, GBR12909, nomifensine이 가장 크게 저해하였으며, amitryptyline, clomipramine, imipramine, desipramine, kinupril, amineptine순으로 그 저해 강도가 평가되었으며 이는 Usdin등(Usdin등 1991)의 연구와 유사한 결과였다.
본 연구에서 사용한 모든 항 정신병 약물도 향정신성 약물처럼 도파민 수송체의 도파민 수송 저해 효과를 보였는데, 그 저해 효과는 향 정신성 약물보다는 대체로 낮게 평가되었으며, 항 정신병 약물의 약리 기전에 따른 저해 강도의 차이는 보이지 않았다. 특히 norepinephrine 수용체에 작용함으로써 그 약리 효과를 나타내는 항정신 약물인 thioridazine은 IC50치가 3.44uM로써 항 우울제인 amitryptyline의 4.01uM 보다도 강한 저해능을 나타냈으며 도파민 수용체에 작용하는bromperidol도 비교적 강한 저해능을 보였다. 반면 mesoridazine이나 clozapine은 그 IC50치가 각 165.87uM, 96.34uM로써 도파민 수송체에 대한 작용이 비교적 작은 약물로 평가되었다.
본 연구 결과에 제시하지는 않았지만 항 정신병 약물의 도파민 수송에 대한 kinetics상, 항정신병 약물에 의해 도파민 수송 활성의 V max뿐만 아니라 K m치도 변하는 것으로 평가되었으며 이는 항정신병 약물의 도파민 수송체의 도파민 수송 저해 효과는 항우울제등에서와 같은 단순한 경쟁적 저해와 아울러 그 이외에 보다 복잡한 기전에 의할 것으로 사료된다. 본 연구에서는 항 정신병 약물이 어떠한 기전을 통해 도파민 수송체의 활성을 저해하는지에 대해서는 입증하지 못하였으나 지금까지 입증된 여러 연구 결과를 토대로 항우울제와 같은 경쟁적 저해 기전이외에 다음과 같은 가능한 약리 기전을 통할 것으로 추측되어진다. 도파민 수송체의 도파민 수송은 Na＋이온의 수송과 함께 일어나므로 세포외액의 Na＋이온 농도에 절대적으로 의존적이며 이에 세포외액에 Na＋이온 농도를 감소시키면 도파민 수송체의 도파민 수송능이 현저히 감소한다(Shimada등 1991). 이에 사용한 항정신병 약물 전부 또는 일부는 Na＋ 투과성을 증가시키는 약제나 oubain과 같은 Na＋, K＋-ATPase 저해제로 작용할 수도 있을 것으로 추측된다(Holz와 Coyle 1974；Sirinathsinghji등 1988). 둘째로 Kitayama(Kitayama등 1994)와 Lee(Lee등 1996)는 도파민 수송체의 기능이 단백질 인산화효소 C(protein kinase C)에 의한 세포내 인산화에 의해 저해된다고 보고하였으며, 본 연구에서 사용한 약제들이 세포내 인산화에 영향을 미쳐 도파민 수송체 활성 저하가 초래될 가능성이 있다. 세째로 amphetamine을 비롯해 일부 정신, 신경계에 작용하는 약물들은 신경세포에서 세포외액으로 도파민의 분비를 촉진시키는 것으로 알려졌으며(Pifl등 1995；Wall등 1995；Eshleman등 1993), 이에 본 연구에 사용한 약물들도 도파민 수송체에 의해 흡수된 도파민을 다시 분비시킴으로써 세포안으로의 도파민 수송이 저해되는 것과 같은 결과를 보였을 수도 있다. 마지막으로, 각 항정신병 약물의 세포독성에 관한 연구 결과를 참조하여 세포 독성을 유발하지 않을 것으로 예상되는 농도를 선택하여 본 실험을 시행하였으나, 그렇다 하더라도 본 약제에 의해 세포막 손상 등의 각종 세포독성이 유발되었을 가능성을 전혀 배제할 수는 없으며, 이에 세포 손상에 의한 도파민 수송체 활성 저하가 초래되었을 수도 있다.
본 연구에서는 각종 항정신병 약물이 도파민 수송체의 활성에 미치는 영향을 구명함으로써 항정신병 약물의 새로운 약리 효과를 정립하였으며, 이와 같은 결과는 실제 생체내의 도파민 분비 신경세포의 synaptic cleft에서 도파민의 과잉(overflow)을 초래할 것이며, 이를 통해 항정신병 약물을 장기 복용시 발생하는 지연상 운동장애(tardive dyskinesia) 등의 각종 부작용 기전 및 약제 내성 기전이 설명되어질 수 있을 것으로 사료된다.
결론
본 연구에서는 도파민 수송체 영구 발현 세포주 CV(bDAT)를 제조하였으며 이를 이용해 항정신병 약물이 도파민 수송체의 도파민 수송능에 미치는 영향을 추구하였으며 이에 다음과 같은 결과를 얻었다.
1) 본 연구에서 확립한 도파민 수송체 영구 발현 세포주 CV(bDAT)는 도파민 수송체가 발현되지 않은 일반 세포주에 비해 현저히 높은 도파민 수송능을 보였으며, saturation analysis상 도파민 수송에 관한 본 수송체의 K m치는 991.6 nM로 분석되었다.
2) 기존에 도파민 수송체 활성에 대한 저해 효과가 입증된 향정신성 약물의 도파민 수송 저해강도를 평가하였을 때, 코카인 유사체인 CFT와 GBR12909는 도파민 수송체의 도파민 수송능을 비교적 낮은 농도에서도 현저히 저해하였으며, 항 우울제 중에는 nomifensine이 가장 강력한 도파민 수송 저해제인 것으로 분석되었고, 그 다음은 amitryptyline, clomipramine, imipramine, desipramine, kinupril, amineptine의 순이었다.
3) 항 정신병 약물도 향정신성 약물과 같이 도파민 수송체의 도파민 수송을 저해하였으며, 그 약리 기전에 따른 저해 강도의 차이는 없었다. 사용한 항정신병 약물중 thioridazine, bromperidol이 가장 강한 도파민 수송체 활성 저해제였으며, 그 다음은 clopixol, haloperidol, risperidone, chlorpromazine, clozapine, mesoridazine의 순으로 분석되었다.