Korean Journal of Biological Psychiatry

서론
동양과 서양의 문화교류가 활발히 진행되면서 의학분야에서도 동서양의 이해가 깊어지고 또한 동양의학에 대한 관심이 높아졌다. 동양의학은 오랜 경험과 특이한 관점으로 발전하였으나, 서양의학처럼 과학적이고 논리적이지 못하여 객관적으로 증명되지 못한 부분이 많아 최근에 와서 동양의학을 과학적 논리적으로 이해하고 설명하려는 노력이 많이 진행되고 있다.
한편 신경정신의학에서도 동양의 신경정신의학에 대한 관심이 높아지고 있으나 질병의 특수성과 증상의 복잡성, 원인의 불분명성 등에 따라 원인과 기전에 대한 연구 및 발전이 늦고 체계가 아직 덜 정돈된 상태이다.
신경정신과 환자에서 가장 흔히 부딪히는 문제들 중 하나가 불면증이며 Weiss 등(1962)에 따르면 신경정신과 외래환자들중의 72%, 다른 일반환자들중의 22%, 그리고 건강한 사람의 경우 약 15%가 불면증을 경험한다고 한다.
불면증은 이렇게 매우 흔한 증상임에도 불구하고 이에 대한 과학적 연구와 규명은 아직 초기단계에 있는 상태이다. 이러한 불면증의 치료에서 그 원인적 치료가 기본이지만 아직은 연구단계이고 임상에서는 많은 경우에 수면제를 사용하고 있는 실정이다. 그러나 대부분의 불면증 환자나 치료자들은 수면제사용에 거부감과 저항감을 갖고 있어 치료에 어려움을 겪고 있다. 따라서 습관성있는 약이거나 수면제가 아닌 불면증 치료제를 찾으려고 연구하던 중 본 연구진들은 산조인이 동양의학에서 오랫동안 불면증 치료에 사용되어 왔다는 동의보감(허준 1969)에 기록된 사실에 관심을 갖고 본 연구를 시작하게 되었다.
산조인(zizyphus seed)은 우리나라를 비롯한 동남아시아 지역에 광범위하게 분포된 묏대추나무(Zizyphus Vulgaris. Lamark Var. Spinosus Bunge)열매의 씨로서 예로부터 신경안정작용이 있다고 하여 한방에서도 불면증의 치료에 많이 사용되어왔다. 동의보감에 의하면 산조인은 잠을 많이 잘 경우, 치료에는 그대로 볶지 말고 사용하고 잠이 적은 불면증에서는 약간 볶아서 사용하라고 하였다.
산조인의 유효성분중 Kawaguchi와 Kim(1940a, 1940b)은 betulinic acid(C30H48O3)를 분리하여 이 성분이 수면작용과 깊은 관계가 있다고 보고한 바 있다. 한편 산조인의 peptide alkaloid 의 하나인 fragufoline을 열처리하여 l-phenylalanine 단기를 d-phenylalanine 단기로 변화시키면 sanjoinine-Ah₁이 되며, 이 성분이 수면과 깊은 관계가 있다고 Han 등(1987) 그리고 Han과 Park(1987)이 보고한 바 있다. 한편 산조인은 진정작용(Okamura 등 1981a), 안정작용(Cyong과 Hanabusa 1980)이 있다고 한 보고도 있다. 그리고 진정작용에 대한 동물실험에서는 x-maze와 자발성운동의 연구방법 등(박영현 1987)이 있다. 그러나 산조인에 관한 논문들 대부분이 수면시간 연장에 관한 논문들로서 진정한 수면작용 물질인지 안정 및 진정작용 물질인지에 대한 연구는 부족한 실정이다.
다른 여러 물질의 진정수면작용에 대한 연구는 많은 학자들이 연구하고 있으나 인체실험의 곤란함, 연구방법의 복잡성, 연구결과에 대한 객관성 등의 문제점으로 어려움을 겪고 있는 실정으로 요즘은 수면물질을 동물에 투여하여 그 반응을 보는 방법, 수면물질을 측정하는 방법, 그리고 뇌파를 측정하는 방법이 많이 이용되고 있다. 한편 수면물질에 대한 연구로서 뇌의 봉선핵에서 분비된다는 세로토닌과의 관계성이 많이 연구되고 있으며 세로토닌이 수면물질로서 인정받고 있다.
본 연구에서는 인간과 생체반응이 유사한 쥐를 실험대상으로 하여 실험하였으며 특히 수면물질로는 한방에서 불면증에 사용하는 산조인 중 과학적으로 수면물질로 인정된 물질인 betulinic acid와 sanjoinine-A(＝fragufoline)의 진정수면작용을 알아보았다. 또한 혈액 내에서 수면과 세로토닌과의 관계를 알아보았으며 쥐에서의 수면뇌파를 기록하여 수면진정물질들과의 반응을 알아보았다. 한편 쥐의 뇌에서도 수용체가 인정된 lorazepam을 사용하여 혈액내의 세로토닌과 뇌파 및 산조인과의 관계도 알아보았다. 그리고 수면작용이 아닌 진정작용의 여부를 알아보기 위해 실험물질 투여후 일정시간동안의 자발운동량을 측정하여 진정작용의 유무를 알아보았다.
방법
1. 실험재료
실험동물은 체중 200∼300gm의 Spraque-Dawley 흰쥐 수컷을 사육실에서 실험 7일 전부터 물과 일정사료로 사육하여 실험 환경에 적응시켰다. 실험재료는 우선 산조인의 성분인 betulinic acid(Aldrich사, 미국)를 구입하여 5%의 gum arabia에 녹여 사용하였다. sanjoinine-A는 Han 등(1987)이 분리한 성분으로 생리식염수에 녹여 사용하였다. lorazepam은 주사제(일동제약)를 사용하였다.
2. 실험방법
1) Thiopental sodium 수면시간 연장에 대한 실험
실험동물군은 4군으로 구분하였다. 1군은 생리식염수 투여군 8마리로 각각 0.23ml을 투여하고, 2군은 betulinic acid 투여군 8마리로 3mg/kg를 0.23ml의 gum arabia에 녹여 투여하고, 3군은 sanjoinine-A 투여군 8마리로 3mg/kg를 0.23ml의 생리식염수에 녹여 투여하고, 4군은 lorazepam 투여군 8마리로 0.033mg/kg를 0.23ml의 생리식염수에 섞어 투여 하였다.
Betulinic acid와 sanjoinine-A의 용량은 Han 등(1987)의 연구를 참고로 하였으며, lorazepam의 용량은 정신과 환자에게 사용되는 일반 용량을 쥐의 체중과 연관시켜 정하였다.
투여방법은 복강내주사를 하였으며. 각 물질을 복강내주사하고나서 30분후 주위 자극이 없는 상태에서 thiopental sodium을 40mg/kg를 복강내 주사하였으며 수면시간은 정좌반사(righting reflex)가 소실되는 시점부터 회복되는 시점까지를 기준하였다.
쥐는 야행성동물이므로 낮에는 체내수면물질의 작용에 의해 생리적으로 수면작용이 충족된 상태로서 이때에는 체외에서 수면물질이 추가로 공급되어도 뇌조절기구가 작동하여 그 효과가 제대로 작동하지 못한다(井上昌次郞 1991). 그리고 내인성수면물질은 1일 주기변동에 따라 영향을 받기 때문에 모든 실험은 쥐가 각성상태가 되기 시작하는 일몰시간인 오후 6시경에 시행하였다.
2) 수면뇌파 및 근전도 측정
실험동물 각군에 해당하는 쥐 각각 2마리씩을 pentobarbital 40mg/kg로 마취한 후 머리부분 3부위와 후경부 근육의 한 부위에 전극을 고정하였다. 3일 후 생리식염수, betulinic acid, sanjoinine-A, lorazepam을 각각 0.23ml, 3mg/kg, 3mg/kg, 0.033mg/kg씩 투여하였으며 30분 후 thiopental sodium을 40mg/kg 주사하였고 이후 30분 동안 뇌파 및 근전도를 측정하였다. Thiopental sodium의 용량은 저자들의 예비연구의 결과에 의해 정했으며, 안영수 등(1982)에 의하면 sanjoinine-A 및 sanjoinine-A1을 투여한 후 수면시간이 평균 30∼40분간 지속된다고 보고된 바 이에 따라 뇌파 및 근전도의 측정을 30분간 시행하였다.
3) 혈청세로토닌치 측정
실험동물을 8마리씩 4군으로 나누어 실험물질을 주사후 30분에 흉부절개하여 심장에서 혈액을 2cc씩 채취하여 ependolf tube에 담아 -70℃에 보관하였다가 서울임상병리검사센터에 보내 high performance liquid chromatography(HPLC)로 세로토닌을 측정하였다. 안영수 등(1982)과 Han과 Park(1987)의 연구에서 실험물질 주사후 30분에 마취제를 주사한후 수면시간을 측정한 방법을 참조하여 본 연구에서도 주사후 30분에 실험동물의 혈액을 채취하였다.
4) 자발운동량 측정
실험대상군 각군마다 8마리씩에 생리식염수, betulinic acid, sanjoinine-A, lorazepam을 각각 투여하고 30분후에 자발운동측정기구를 사용하여 30분동안 자발운동량을 측정하여 진정작용유무를 알아보았다.
실험동물의 자발운동량 측정에는 자발운동측정상자(42×26×15cm) Natsumex(하목 제작소 Model KN70)를 이용하여 실험동물의 작은 체동을 제외한 수평방향이나 수직방향의 자발운동(spontaneous motor activity)을 측정하였으며 약물투여 30분 후에 올려 놓고 30분 동안 측정하였다.
5) 자료분석
본 연구에서 얻어진 자료의 분석에는 SPSS/PC＋를 사용하였는데 각 군간의 차이를 평가하기 위해 분산분석(analysis of variance)를 이용하였다.
실험성적
1. 수면시간 연장에 대한 실험
수면시간의 변화는 생리식염수 투여군이 86.2±14.1분, betulinic acid 투여군이 108.5±11.6분, sanjoinine-A 투여군이 101.78±8.03분, lorazepam 투여군이 102.6±16.1분으로 나타났다(Table 1).
실험결과 각군의 비교에서 betulinic acid 투여군이 생리식염수 투여군보다 수면시간이 더 길게 나타났으며(p<0.01), sanjoinine-A군과 lorazepam투여군은 생리식염수 투여군에 비해 수면시간이 더 길게 나타났다(p<0.05). 한편 betulinic acid투여군과 sanjoinine-A투여군 및 lorazepam투여군 간에는 통계적으로 의의있는 차이가 없었다.
2. 뇌파 및 근전도 실험
실험대상 동물에게 각 실험물질 및 thiopental sodium을 투여후 찍은 뇌파의 소견에서 생리식염수군은 전체적으로 β-wave가 많이 나타났고 betulinic acid 및 sanjoinine-A투여군 및 lorazepam 투여군에서도 전반적으로 β-wave가 많이 나타났다(Fig. 1, 2, 3, 4).
근전도에서는 각 군간에 의의있는 차이가 나타나지 않았고 REM 수면과 non-REM수면을 구별할 수 있는 근전도파는 나타나지 않았다.
3. 혈청 세로토닌치의 결과
실험동물각군에서의 세로토닌의 농도는 생리식염수 투여군에서는 평균 320±122ng/ml, betulinic acid 투여군에서는 평균 510±215ng/ml, sanjoinine-A 투여군에서는 평균 464±219ng/ml, lorazepam 투여군에서는 평균 442±131ng/ml로 각 군간의 통계적인 유의한 차이는 없었다(Table 2).
4. 자발운동량 측정
자발운동량을 측정하여 본 결과 betulinic acid투여군은 평균 568.7±229.2로서 생리식염수 투여군(834.4±194.4)보다 자발운동량의 감소를 보였고(p<0.05), sanjoinine-A투여군과 lorazepam투여군은 각각 평균 525.7±163.8과 438.6±209.3로서 생리식염수투여군보다 자발운동량이 감소하였다(p<0.01). 한편 betulinic acid군, sanjoinine-A군, lorazepam군들 사이에는 의의있는 차이가 없었다(Table 3).
고찰
산조인은 오래 전부터 한방에서 신경안정작용이 있다고 하여 불면증 치료에 사용되어져 왔다. 약물학적 연구에서 산조인의 작용은 수면작용과 진정작용(Okamura 등 1981b), 안정작용과 진통작용, 항부정작용(Antiarrhythmic)(Cyong과 Hanabusa 1980), 소염작용과 혈압강하 작용(Han 등 1987)이 있다고 보고된 바 있다.
산조인의 불면증에 대한 유효성분은 Kawaguchi와 Kim(1940a, 1940b)이 betulinic acid를 분리한 이래 betulinic 지방유 및 sitosterol 등이 함유되어 있음이 밝혀졌고(Watanabe 등 1973), Kawai 등(1974)은 산조인의 saponine에서 sapogenine을 순수 분리하였으며, Otsuka 등(1978)은 Saponine Jujuboside a와 b의 구조까지 밝혔다.
Watanabe 등(1973)은 산조인의 수용성 물질뿐만 아니라 지용성 추출물에서도 중추신경 억압효과를 관찰하였고 특히 hexobarbital 수면작용의 연장은 수용성 물질에서 중추신경 억압작용이 더 강하다고 하였다. 한편 한방문헌에는 잠이 많을 때는 생산조인을 불면에는 볶은 산조인을 사용한다고 하였다(과학·백과사전출판사 1994).
한 등(1987)은 sanjoinine-A와 sanjoinine-Ah1을 분리하였으며, sanjoinine-A를 열처리하여 l-phenylalanine 잔기를 d-phnylalanine 잔기로 변화시켜 진정작용이 더 강한 sanjoinine-Ah1이 된다고 보고한 바 있다(Kawaguchi와 Kim 1940b). 또한 산조인은 독성작용이 약해서 실험동물에게 20gm/kg을 주어도 죽지 않는다고 보고되기도 하였다.
산조인에 대한 수면 및 진정작용에 대한 연구는 betulinic acid와 sanjoinine-A에 대한 연구를 하는 것이 산조인 생약을 직접 연구 조사하는 것보다 그 작용기능을 더 잘 알 수 있고 더 정확히 알 수 있을 것으로 생각되어 상기 두 물질에 대한 연구를 시행하였다. 생약성분의 기능을 알기는 어려운 점이 많고 특히 수면 진정작용을 알아내기는 더욱 어려운 문제점
이 많다.
안영수 등(1982)의 연구에서 산조인 투여 30분후 thiopental sodium으로 수면유도 한 다음 정좌반사소실에서 정좌반사의 회복까지를 수면 진정작용의 기간으로 설정한 연구를 참조하여 본 연구에서도 betulinic acid 3mg/kg을 투여한 군과 sanjoinine-A를 3mg/kg 투여한 군에 30분후 thiopental Sodium 40mg/kg 주사후 정좌반사의 반응을 조사함으로써 상기물질들의 수면 또는 진정작용을 알아보았다.
한편 쥐나 소에서 benzodiazepine receptor가 존재한다는 것이 입증되었는데 lorazepam이 이 수용체에 작용하여 진정수면작용을 일으킨다고 한다(井上 1991). 따라서 상기 산조인의 진정 수면 작용과 lorazepam의 진정수면 작용을 비교하기 위하여 lorazepam을 0.033mg/kg투여하여 같이 비교하였다.
실험대상군을 생리식염수, betulinic acid, sanjoinine-A, lorazepam을 복강내 투여 30분후 thiopental sodium 40mg/kg를 복강내 주사하였고 그 후 정좌반사 소실에서 정좌반사 회복까지의 수면시간을 측정한 결과 각 군간의 유의한 차이가 있었다. Betulinic acid, sanjoinine-A로 lorazepam군이 생리식염수군에 비해 수면연장시간이 의의 있게 높았고 상기 3군간에는 차이가 없었다. 이는 다른 연구들의 결과들과 비슷하며 실험동물에서 수면연장작용이 있다고 인정되고 있다. 그러나 아직 산조인 성분들이 진정한 수면작용인지 안정 및 진정작용의 효과에 의해 수면이 연장되었는지는 결론짓기 곤란한 상태이다.
요즘 수면연구는 polysomnogram으로 많은 연구가 진행되고 있다. 그래서 각군의 실험동물 2마리씩에게 전극을 두피 3곳에 고정시키고 후정부의 근육에 한개의 전극을 고정시켜 실험물질을 투여후 뇌파를 측정하고 또 30분후 thiopental sodium을 주사하여 뇌파를 측정하였다. 이 결과 모든 군에서 β-wave가 많이 나타났고 또한 쥐가 자주 움직여 잡파가 많이 나타났다. Thiopental sodium 주사 후 실험동물군중 각 실험동물군에서 모두 β-wave가 많이 나타났다. 이는 betulinic acid군과 sanjoinine-A투여군에서 진정한 수면을 일으키기보다 깊은 진정상태가 나타난다고 추론해 볼 수도 있겠다.
생리식염수군에서도 β-wave가 많이 나타난 것을 thiopental sodium의 영향으로 해석할 수 있겠다. 근전도를 추가한 이유는 non-REM과 REM의 구별을 위하여 시행했으나 실제검사결과에서는 non-REM과 REM을 구별할 수 있는 수면 뇌파상태는 나타나지 않았다. 따라서 상기물질들의 수면시간연장은 수면뇌파의 소견을 보이는 시간연장이라기보다 안정진정작용의 연장에 의한 것이 아닌가 추정된다.
수면에 대한 신경생리학적 기전은 아직 규명되어 있지는 않지만 대표적인 수면작용물질로서는 세로토닌이 가장 많이 논의되고 있는 실정이다.
각 실험물질 투여 후 혈중에서 세로토닌 농도의 차이가 없었던 결과는 각 실험물질이 수면시간연장에 세로토닌이 작용하지 않는다는 것을 추정할 수 있겠고, 또한 수면뇌파소견도 보이지 않는 것은 이런 실험물질들이 수면작용물질이라기보다 안정, 진정작용의 물질일 것으로 추론되고 있다.
마지막 실험에서 실험동물들의 진정작용을 알아보기 위해 자발운동을 측정하였다. 요즘 동물실험에서 동물들의 진정작용측정은 x-maze 방법이나 자발운동 측정방법이 사용되고 있다(박영현 1987).
측정결과 betulinic acid투여군, sanjoinine-A투여군, lorazepam투여군에서 대조군에 비해 의미 있게 자발운동량의 감소를 보였고 betulinic acid투여군과 sanjoinine-A투여군은 lorazepam투여군과 비슷한 결과를 나타내었다. 이는 betulinic acid와 sanjoinine-A가 lorazepam과 같이 수면작용의 결과를 나타내지 못했지만 진정작용의 결과를 나타냈다고 추론할 수 있겠다.
종합하면 상기물질들이 진정작용이 있다고 생각되며 세로토닌과의 관계는 연관되지 않은 것으로 해석되며 차라리 다음 연구에서는 진정작용과 관계가 깊다고 인정되고 있는 뇌신경전달물질인 GABA와 연관시켜 연구하는 것이 더 바람직하다고 생각된다. 그리고 sanjoinine-A와 betulinic acid의 투여량 및 관찰-측정시간 등 방법의 보완으로서 수면작용에 대한 평가를 심도있게 추가로 연구해보는 것이 좋겠다고 생각된다.
결론
산조인의 진정작용 및 수면작용의 효과를 알아보기 위해 산조인의 주요 수면유발 물질로 인정되고 있는 betulinic acid와 sanjoinine-A를 쥐에 투여한 후 lorazepam과 생리식염수 군을 비교하였다. 각 군에서 수면시간 연장, 뇌파측정, EMG 측정, 혈중 세로토닌 level 측정, 자발운동측정을 시행한 바 다음과 같은 결과를 얻었다.
1) 수면시간 연구에서 betulinic acid군, sanjoinine-A군, lorazepam군은 생리식염수 대조군에 비해 수면시간연장을 나타내었다.
2) 수면뇌파측정에서 betulinic acid군, sanjoinine-A군, lorazepam군, 생리식염수군 모두에서 β-wave가 많이 나타났으며, 근전도에서의 이상소견은 발견되지 않았다.
3) 혈중 세로토닌의 측정에서 betulinic acid투여군, sanjoinine-A투여군에서 lorazepam투여군과 생리식염수 투여군의 비교에서 특이한 차이가 나타나지 않았다.
4) 자발성 운동측정실험에서 betulinic acid투여군, sanjoinine-A투여군과 lorazepam투여군에서는 생리식염수 투여군에 비해 의미 있게 행동감소가 나타난 바 있으며 betulinic acid군과 sanjoinine-A투여군은 lorazepam투여군과 비슷한 결과를 나타내었다. 이는 실험물질이 실험동물들에게 진정작용이 있다고 추정된다.
따라서 산조인에서 진정수면작용이 있다고 알려진 물질인 betulinic acid와 sanjoinine-A는 세로토닌과 관계없고 lorazepam과 비슷한 진정작용의 물질인 것으로 추론된다.